Методические указания « Методы микробиологического контроля готовых изделий с кремом» (Утверждены постановлением Главного Государственного санитарного врача Кыргызской Республики)

ПРЕКРАТИЛ ДЕЙСТВИЕ

в соответствии со статьей 36 Закона КР

от 20 июля 2009 года № 241

"О нормативных правовых актах Кыргызской Республики"

Зарегистрировано в Министерстве юстиции Кыргызской Республики

19 марта 2004 года. Регистрационный номер 37-04

Утверждены

постановлением Главного

Государственного санитарного

врача Кыргызской Республики

от 20 февраля 2004 года № 10

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ КЫРГЫЗСКОЙ РЕСПУБЛИКИ

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Методы микробиологического контроля

готовых изделий с кремом

Методические указания

МУК М.4.2.002-03

Настоящие методические указания переработаны Департаментом госса-

нэпиднадзора Министерства здравоохранения Кыргызской Республики в соот-

ветствии с Законом Кыргызской Республики "О санитарно-эпидемиологичес-

ком благополучии населения", Положением "О государственном санитар-

но-эпидемиологическом нормировании", Положением "О государственной са-

нитарно-эпидемиологической службе Кыргызской Республики", утвержденными

постановлением Правительства Кыргызской Республики от 10.12.2001 г. №

778, с учетом МУ 4.2.762-99, разработанного ведущими научно-исследова-

тельскими институтами Российской Федерации.

1. Общие положения

1.1. Настоящие методические указания устанавливают методы лабора-

торных исследований (испытаний) качества готовых изделий с кремом по

микробиологическим показателям безопасности для здоровья человека, про-

водимых в порядке производственного контроля, государственного санитар-

но-эпидемиологического надзора, а также при испытании указанной продук-

ции в целях сертификации соответствия.

1.2. Методические указания предназначены для применения в аккреди-

тованных бактериологических производственных, испытательных лаборатори-

ях и лабораториях организаций Государственной санитарно-эпидемиологи-

ческой службы Кыргызской Республики, осуществляющих контроль качества и

безопасности готовых изделий с кремом, и позволяют проводить контроль

на соответствие СанПиН 2.3.2.560-96 "Гигиенические требования к качест-

ву и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов".

1.3. Данный документ разработан в связи с необходимостью совер-

шенствования методов микробиологического анализа в соответствии с реко-

мендациями ФАО/ВОЗ.

Методы адаптированы к условиям работы лабораторий, осуществляющих

контроль качества и безопасности готовых изделий с кремом.

1.4. Для правильного выбора массы продукта, засеваемой при контро-

ле за отсутствием бактерий группы кишечных палочек (колиформных бакте-

рий), S. aureus, патогенных микроорганизмов, в т.ч. сальмонелл, в мето-

дические указания включены микробиологические нормативы, соответствую-

щие СанПиН 2.3.2.560-96 "Гигиенические требования к качеству продоволь-

ственного сырья и пищевых продуктов", а также микробиологические норма-

тивы в соответствии с утвержденной в установленном порядке нормативной

документацией на изделия с кремом, производимые по усовершенствованным

технологиям, с использованием новых видов жиров и т.д.

1.5. Настоящие методические указания должны учитываться при перес-

мотре действующей и разработке вновь создаваемой нормативной документа-

ции на готовые изделия с кремом, вырабатываемые хлебопекарными и конди-

терскими предприятиями и цехами, и компоненты, используемые при их из-

готовлении.

2. Методы отбора, доставки и подготовки

проб к анализу

2.1. Отбор проб

2.1.1. Качество изделий с кремом оценивают по результатам анализа

части продукции, отобранной из партии. Партией считают продукцию одного

вида, сорта и наименования, выработанную за одну смену и оформленную

документом о качестве установленной формы. Документ о качестве должен

содержать:

- наименование продукции;

- наименование и адрес изготовителя;

- номер и дату выдачи;

- дату и час выработки;

- условия хранения и сроки годности;

- подтверждение о соответствии качества продукции нормативно-тех-

нической документации;

- обозначение нормативно-технической документации.

2.1.2. При отборе проб следует руководствоваться ГОСТом 26668-85

"Продукты пищевые и вкусовые. Методы отбора проб для микробиологических

анализов" и ГОСТом 5904-82 "Изделия кондитерские. Правила приемки, ме-

тоды отбора и подготовки проб".

Для составления объединенной пробы от выборки отбирают:

- для тортов не менее 1 шт. массой не менее 300 г;

- для пирожных в ассортименте - не менее 10 шт. массой менее 50 г,

не менее 6 шт. массой 50-60 г, не менее 5 шт. массой 65-75 г, не менее

4 шт. массой 80-90 г, не менее 3 шт. массой 100-200 г.

Отбор проб производят, вскрывая определенное количество транспорт-

ных единиц упаковки, оговоренное в нормативно-технической документации,

и изымая часть продукции. Пробы отбирают асептически с помощью стериль-

ных инструментов в стерильную посуду таким образом, чтобы в них были

представлены все компоненты изделий в соотношении, наиболее близком к

составу анализируемых тортов или пирожных.

2.1.3. Пробу, отобранную из отдельной единицы упаковки, называют

разовой. Количество продукта в разовых пробах из каждой единицы упаков-

ки должно быть одинаковым. Разовые пробы соединяют, перемешивают и сос-

тавляют среднюю пробу. Средняя проба должна быть отобрана таким обра-

зом, чтобы ее состав соответствовал всей партии. Масса средней пробы

должна быть не менее 250 г.

2.1.4. Банку с пробой снабжают этикеткой, на которой указывают:

- номер пробы, дату и час отбора пробы;

- наименование продукции;

- номер и объем партии;

- дату и час выработки продукции;

- должность и подпись лица, отбиравшего пробу;

- обозначение действующей нормативно-технической документации, по

которой вырабатывалась продукция.

Пробу, отправляемую в лабораторию вне данного предприятия, пломби-

руют или опечатывают и снабжают этикеткой, на которой дополнительно

указывают наименование предприятия-изготовителя.

2.2. Доставка и хранение проб

2.2.1. Доставка проб в лабораторию должна осуществляться, по воз-

можности, специальным автотранспортом в термоконтейнерах с охлаждающими

вкладышами не позднее 2 ч с момента их отбора.

2.2.2. Бактериологическое исследование продукции производят не

позднее, чем через 4 ч с момента отбора пробы. Образцы до начала иссле-

дования сохраняют при температуре от 2 до 6 град. Цельсия.

2.3. Подготовка проб к анализу

2.3.1. Подготовка проб к анализу проводится по ГОСТу 26669-85

"Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических

анализов" и ГОСТу 5904-82 "Изделия кондитерские. Правила приемки, мето-

ды отбора и подготовки проб". Все работы проводят с помощью стерильных

инструментов в стерильных условиях.

2.3.2. Среднюю пробу асептично помещают в стерильный стакан гомо-

генизатора или фарфоровую ступку и тщательно измельчают до однородной

массы (при необходимости можно добавить 2-5 г стерильного кварцевого

песка).

2.3.3. Приготовление разведений для посева.

2.3.3.1. Навеску массой 10,0 (+-) 0,1 г, приготовленную по

п.3.3.2, отбирают из средней пробы изделия и асептично вносят в колбу с

90 куб.см стерильного физиологического раствора (п.6.3.1.2) или

0,1%-ной пептонной воды (п.6.3.1.1), тщательно перемешивают круговыми

движениями и помещают на водяную баню либо в термостат при 45 град.

Цельсия на 15-20 мин., либо на аппарат для встряхивания при той же тем-

пературе на 3-5 мин. до получения однородной взвеси. 1 куб.см приготов-

ленной таким образом взвеси (гомогената) содержит 0,1 г исследуемого

образца (первое разведение). Если при гомогенизации продукта получена

неоднородная взвесь, то ее отстаивают в течение 15 мин. и для посева и

(или) приготовления разведений используют надосадочную жидкость.

2.3.3.2. Из первого разведения образца стерильной пипеткой берут 1

куб.см и переносят в пробирку, содержащую 9 куб.см стерильного раство-

ра. Другой пипеткой взвесь перемешивают 5-10 раз и получают второе раз-

ведение (1:100). При необходимости последующие разведения готовят таким

же образом. При приготовлении разведений каждый раз используют новую

пипетку, опуская конец пипетки в жидкость не более чем на 2 см ниже

уровня. Перед посевом разведения осторожно встряхивают.

2.3.4. Время от момента приготовления разведений до посева не

должно превышать 30 мин.

3. Методы анализа

При контроле микробиологического качества и безопасности конди-

терских изделий с кремом используют стандартизованные методы микробио-

логического посева. При этом определяют следующие группы микроорганиз-

мов: мезофильные аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы,

бактерии группы кишечных палочек (колиформные бактерии), S. aureus и

патогенные микроорганизмы, в т.ч. сальмонеллы, дрожжи и плесени.

При выявлении или определении количества микроорганизмов соответс-

твующих групп необходимо руководствоваться ГОСТом 26670-91 "Продукты

пищевые. Методы культивирования микроорганизмов".

При проведении посевов на селективные среды накопления для опреде-

ления условно-патогенных и патогенных микроорганизмов рекомендуется ис-

пользовать контрольные культуры соответствующих микроорганизмов, кото-

рые следует изучать параллельно с культурами, выделенными из, исследуе-

мых образцов тортов и пирожных.

В аккредитованных микробиологических лабораториях, осуществляющих

контроль качества и безопасности кондитерских изделий с кремом, допус-

кается использование автоматизированных экспресс-методов микробиологи-

ческого контроля.

Для автоматизированного микробиологического экспресс-контроля при-

меняют компьютеризированные приборы, представляющие собой измерительные

системы для определения микробной обсемененности и выявления различных

микробов, принцип действия которых основан на регистрации относительно-

го изменения электрического сопротивления оптической плотности, турби-

диметрического или колориметрического эффекта питательных сред, проис-

ходящих под влиянием процессов роста и размножения микроорганизмов. Для

этих целей применяют микробиологические экспресс-анализаторы БакТрак

4100 (Австрия), Рэббит (Англия), Мальтус (Ирландия), Бактометр (Фран-

ция), БакТ/Алерт (США), Биоскрин (Финляндия) или другие приборы анало-

гичного назначения.

Анализаторы позволяют определять мезофильные аэробные и факульта-

тивно-анаэробные микроорганизмы, условно-патогенные и патогенные микро-

организмы (колиформы, сальмонеллы, стафилококки и др.), дрожжи, плесе-

ни, молочнокислые бактерии и др.

В комплект приборов входят: контролируемые компьютером термостати-

руемые инкубаторные блоки на различное количество образцов, персональ-

ный компьютер, принтер, комплекты измерительных ячеек с электродами

(объемом на 10 и 100 мл), наборы высокоселективных сред, другие матери-

алы.

Использование микробиологических автоматических анализаторов поз-

воляет сократить время на проведение испытаний и получить результаты

анализа уже через 6-8 ч после начала исследования.

Обязательным условием для применения микробиологических анализато-

ров при осуществлении контроля качества продукции является наличие ут-

вержденных в установленном порядке в системе государственного санитар-

но-эпидемиологического нормирования методических указаний, созданных в

результате сравнительных испытаний определения на приборе конкретного

типа со стандартизованными методами микробиологического контроля и

адаптированных к установленным в СанПиН 2.3.2.560-96 нормативным пока-

зателям для кондитерских изделий с кремом.

3.1. Определение количества мезофильных аэробных и

факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ)

3.1.1. Сущность метода.

Метод основан на количественном подсчете колоний микроорганизмов,

вырастающих в глубине и на поверхности плотного питательного агара при

температуре 30 (+-) 1 град. Цельсия в течение 72 ч.

При определении количества мезофильных аэробных и факультатив-

но-анаэробных микроорганизмов руководствуются ГОСТом 26670-91 и ГОСТом

10444.15-94 с учетом нижеизложенных рекомендаций.

3.1.2. Проведение анализа.

Для определения общего количества мезофильных аэробных и факульта-

тивно-анаэробных микроорганизмов выбирают те разведения, при посеве ко-

торых на чашках вырастает не менее 15 и не более 300 колоний.

Перед посевом чашки маркируют. На дно чашки карандашом по стеклу

наносят номер исследуемого образца, разведение и дату.

По 1 куб.см каждого разведения образца, приготовленного по

п.3.3.3, вносят в 2 чашки Петри (параллельное определение). Посевной

материал можно вносить от большего разведения к меньшему, пользуясь од-

ной пипеткой. Пипетку с посевным материалом держат под углом 45 град.,

касаясь концом пипетки дна чашки, не выдувая последнюю каплю из пипет-

ки. Затем, не позже чем через 20 мин., вносят в чашку питательную среду

(п. 6.3.2.3, 6.3.2.5), расплавленную на водяной бане и остуженную до 45

град. Цельсия, осторожно и равномерно перемешивают содержимое чашки.

Высота слоя питательной среды должна быть не менее 4-5 мм.

После застывания среды чашки переворачивают крышками вниз и поме-

щают в термостат при 30 (+-) 1 град. Цельсия на 72 ч (допускается пред-

варительный учет через 48 ч с последующим окончательным учетом еще че-

рез 24 ч).

После инкубации подсчитывают все выросшие колонии на тех чашках,

где их количество составляет 15-300 колоний, при этом чашки располагают

вверх дном на темном фоне. Подсчет производят при помощи лупы с увели-

чением от 4 до 10 раз или специального прибора для счета колоний.

Если инкубированные чашки с разведением 1:10 не содержат колоний,

то результат выражают так: меньше чем 1 х 10' КОЕ (колониеобразующих

единиц) на 1 г исследуемого образца.

Если на каждой из двух параллельных чашек с разведением 1:10 со-

держится меньше чем 15 колоний, то результат выражается так: менее чем

1,5 х 10(2).

Если количество колоний более 15, подсчитывают колонии на обеих

чашках с одним и тем же разведением и вычисляют среднюю величину, умно-

жают среднюю величину на соответствующее разведение и получают число

микроорганизмов в 1 г продукта.

При подсчете микроорганизмов целесообразно руководствоваться ГОС-

Том 26670-85 "Продукты пищевые и вкусовые. Методы культивирования мик-

роорганизмов".

Полученный результат округляют до числа, кратного:

- 5, если среднее арифметическое число микроорганизмов менее 100;

- 20, если среднее арифметическое число микроорганизмов более 100

и оканчивается цифрой 5;

- 10, если среднее арифметическое число микроорганизмов более 100

и не оканчивается цифрой 5.

Ответ выражают в виде числа КОЕ/г с указанием соответствия или не-

соответствия тортов и пирожных микробиологическому нормативу на этот

показатель (см. табл. 2, 3, 4).

3.2. Определение бактерий группы кишечных палочек (колиформных

бактерий)

В соответствии с принятой международной номенклатурой к бактериям

группы кишечных палочек (БГКП) отнесены факультативно-анаэробные, гра-

мотрицательные, не образующие спор палочки, сбраживающие лактозу с об-

разованием кислоты и газа при температуре 36 (+-) 1 град. Цельсия в те-

чение 24-48 ч, в основном являющиеся представителями родов Escherichia,

Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Serratia (т.е. учитываются как

цитратотрицательные, так и цитратположительные варианты БГКП). Методы

исследования на БГКП приведены в ГОСТе Р 50474-93.

3.2.1. Сущность метода.

Метод основан на высеве определенного количества продукта в жидкую

селективную среду, содержащую лактозу для определения сбраживающей спо-

собности по образованию кислоты и газа и, при необходимости, пересева

культуральной жидкости на поверхность плотных специальных агаризованных

сред для подтверждения принадлежности по культуральным и биохимическим

признакам выделенных колоний к колиформным бактериям.

3.2.2. Проведение анализа.

Для посева используют то количество продукта, подготовленного по

п.3.3.3, в котором предусматривается отсутствие БГКП (табл. 2). Посев

производят в среду Кесслер с лактозой (п.6.3.2.5) (с поплавками) в со-

отношении разведения и среды 1:10.

Пробирки или колбы с посевами помещают в термостат при температуре

36 (+-) 1 град. Цельсия на 24-48 ч, после этого посевы просматривают и

при отсутствии признаков роста - газообразования или помутнения среды -

дают заключение об отсутствии БГКП (коли-форм) в исследуемой массе из-

делия.

Из пробирок или колб со средой Кесслер, в которых обнаружено газо-

образование или помутнение, производят пересев на среду Эндо или Левина

(п.6.3.2.6). Посев производят петлей по поверхности хорошо подсушенной

среды штрихами для получения изолированных колоний. Чашки с посевами

помещают крышками вниз в термостат с температурой 36 (+-) 1 град. Цель-

сия на 18-24 ч.

При отсутствии на среде Эндо или Левина колоний, типичных для бак-

терий группы кишечных палочек (на среде Эндо - красных и темно-красных

с металлическим блеском или без него, розовых или бледно-розовых; на

среде Левина - черных с металлическим блеском, темных с черным центром,

сиреневых с темным центром), дают заключение об отсутствии БГКП в исс-

ледуемом количестве изделия и соответствии его нормативу на бактерии

группы кишечных палочек (колиформные бактерии).

При наличии на среде Эндо или Левина колоний, характерных для ки-

шечных палочек, из них готовят мазки, окрашивают их по Граму и микрос-

копируют.

Наличие в мазках-препаратах грамотрицательных, не содержащих спор

палочек, указывает на присутствие бактерий группы кишечных палочек в

анализируемой массе изделия и несоответствие его микробиологическому

нормативу.

При выявлении на среде Эндо мелких бесцветных колоний, подозри-

тельных на наличие возбудителей кишечных инфекций, колонии снимают и

изучают на принадлежность к патогенным микроорганизмам семейства кишеч-

ных (п.4.3), а в случае подтверждения извещают территориальное учрежде-

ние госсанэпиднадзора и при необходимости передают туда для дальнейшей

идентификации.

3.3. Определение бактерий рода Salmonella

Сальмонеллы - обширный род семейства энтеробактерий, включающий

более 2000 сероваров, большинство которых обладает патогенными свойс-

твами. Сальмонеллы - факультативно-анаэробные грамотрицательные, в ос-

новном подвижные палочки или неподвижные (S. pullorum, S. gallinarum и

др.), хорошо растущие на обычных питательных средах и разнообразных пи-

щевых субстратах.

При исследовании образцов на наличие сальмонелл руководствуются

ГОСТом Р 50480-93 с учетом нижеизложенных методических рекомендаций.

3.3.1. Сущность метода.

Метод основан на высеве определенной массы (количества) продукта,

в которой нормируется отсутствие патогенных микроорганизмов, в жидкую

неселективную среду, инкубировании посевов, последующем накоплении бак-

терий в жидких селективных средах, выявлении бактерий, образующих ти-

пичные колонии на агаризованных дифференциально-диагностических средах,

имеющих типичные для бактерий рода Salmonella биохимические и серологи-

ческие характеристики.

3.3.2. Проведение анализа.

Навеску изделия (25 г), соответствующую указанному в табл. 2 нор-

мативу на Сальмонеллы, приготовленную по п.3.3.1, засевают в колбу с

пептонным буферным раствором (п.6.3.2.8) в соотношении 1:9 для предва-

рительного неселективного обогащения. Посевы инкубируют при 36 (+-) 1

град. Цельсия в течение 18-24 ч.

После этого производят пересев культуры из пептонного буферного

раствора в две среды для селективного обогащения. Для этого 10 куб.см

культуральной жидкости переносят в 100 куб.см магниевой среды, приго-

товленной по п.6.3.2.11, и в 100 куб.см тетратионатной среды, приготов-

ленной по п.6.3.2.10 или по 10 куб.см культуры переносят в 100 куб.см

селенитовой среды (п.6.3.2.13) и в 100 куб.см тетратионатной среды.

Посевы инкубируют 24 ч на магниевой и селенитовой средах при тем-

пературе 36 (+-) 1 град. Цельсия, а на тетратионатной среде при темпе-

ратуре 43 (+-) 1 град. Цельсия. Через 24 ч инкубирования культуры пере-

севают на три агаризованные среды: висмут-сульфит агар, среду Плоскире-

ва и среду Эндо (взамен Эндо можно использовать среду Левина).

Допускается использование одной чашки каждой из сред для одновре-

менного высева с двух селективных сред.

Посевы инкубируют при температуре 36 (+-) 1 град. Цельсия в тече-

ние 24-48 ч.

После 24 ч инкубирования посевов проводят предварительный учет ре-

зультатов, а после 48 ч ~ окончательный.

После инкубирования посевов на дифференциально-диагностических

средах отмечают РОСТ колоний, характерных для бактерий рода Salmonell-

la:

- на висмут-сульфит агаре - колонии черные с характерным металли-

ческим блеском, а также зеленоватые с темно-зеленым ободком и с пигмен-

тированием среды под колонией;

- на среде Плоскирева - колонии бесцветные прозрачные, но более

плотные, чем на среде Эндо;

- на среде Эндо - колонии круглые бесцветные или слегка розоватые,

прозрачные;

- на среде Левина - колонии прозрачные, слабо-розовые или розова-

то-фиолетовые.

При отсутствии в посевах на дифференциально-диагностических сре-

дах, характерных для бактерий рода Salmonella колоний дают заключение

об отсутствии бактерий рода Salmonella в анализируемой навеске продук-

та.

При наличии хотя бы на одной дифференциально-диагностической среде

характерных для бактерий рода Salmonella колоний проводят их дальнейшее

изучение.

3.3.3. Биологическое подтверждение принадлежности выделенных ха-

рактерных колоний к бактериям рода Salmonella.

Не менее трех характерных колоний с каждой дифференциально-диаг-

ностической среды (а в случае наличия 1-2 типичных колоний - каждую из

них) пересевают на скошенную поверхность мясо-пептонного агара или сре-

ды из сухого питательного агара, приготовленные по п.6.3.2.4 или

п.6.3.2.5. Часть колоний пересевают штрихом по поверхности и уколом в

столбик трехсахарного агара, приготовленного по п.6.3.2.13.

Посевы инкубируют при температуре 36 (+-) 1 град. Цельсия в тече-

ние 24 ч.

Из отобранных по п.4.3.3 для биохимического подтверждения колоний

приготовляют мазки и окрашивают по Граму (по ГОСТу 10444.1).

Бактерии рода Salmonella являются бесспоровыми грамотрицательными

палочками с закругленными концами.

После инкубации посевов, как указано в п.4.3.3, проводят учет ре-

зультатов ферментации лактозы, глюкозы и сахарозы на трехсахарном ага-

ре:

- пожелтение скошенной части среды указывает на ферментацию лакто-

зы или сахарозы или обоих сахаров (пожелтение столбика среды с разрывом

агара или пузырьками газа указывает на ферментацию глюкозы с образова-

нием кислоты и газа, пожелтение столбика среды без разрывов или пузырь-

ков газа указывает на ферментацию глюкозы до кислоты без образования

газа);

- почернение среды в столбике указывает на образование сероводоро-

да.

Типичными для бактерий рода Salmonella являются культуры, фермен-

тирующие глюкозу с образованием или без образования газа, не ферменти-

рующие лактозу и сахарозу, образующие сероводород.

Дальнейшему изучению подвергаются также лактозоположительные бак-

терии, не образующие сероводород, но обязательно ферментирующие глюкозу

с образованием или без образования газа.

У культур, отобранных согласно п.4.3.3 и пересеянных на поверх-

ность мясо-пептонного агара или среды, приготовленной из сухого пита-

тельного агара, изучают следующие биохимические и физиологические приз-

наки: расщепление мочевины, образование ацетоина и индола, ферментацию

лизина, сахарозы, маннита, салицина и подвижность.

3.3.3.1. Определение расщепления мочевины.

Культуры пересевают штрихом на поверхность агара Кристенсена с мо-

чевиной (п.6.3.2.23). Посевы инкубируют при температуре 36 (+-) 1 град.

Цельсия в течение 24 ч.

При положительной реакции - расщепление мочевины - цвет среды от

розового до светло-вишневого. Для уреазоположительных бактерий реакция

часто становится видимой после 2 ч инкубирования.

Бактерии рода Salmonella не расщепляют мочевину.

3.3.3.2. Изучение ферментации маннита и сахарозы. Культуры пересе-

вают в среды Гисса с маннитом и сахарозой. Посевы инкубируют при темпе-

ратуре 36 (+-) 1 град. Цельсия в течение 24 ч. Бактерии рода Salmonella

не сбраживают сахарозу, но сбраживают маннит. При сбраживании маннита

цвет среды изменяется, образуется или не образуется газ.

3.3.3.2. Определение образования индола.

При исследовании на индол из подозрительной колонии микроорганизмы

высевают в пробирки с 1%-ной петонной водой или среду на индол с трип-

тофаном по п.632.7 и термостатируют при 36 (+-) 1 град. Цельсия 24 ч.

Затем в пробирку с суточной культурой по стенке добавляют 5-10 капель

реактива Эрлиха (п.6.3.1.5). При наличии индола не позднее чем через 5

минут в пограничном слое образуется ярко-красное кольцо, при отсутствии

- кольцо остается светло-желтого цвета.

Для определения индолообразования пользуются также реактивом Кова-

ча (п.6.3.1.6). К суточной культуре добавляют 0,2-0,3 куб.см реактива и

взбалтывают. Результаты учитывают через 10 минут: реактив поднимается

на поверхность среды и при наличии индола окрашивается в темно-красный

цвет.

Бактерии рода Salmonella индола не образуют.

3.3.3.3. Определение образования ацетоина (реакция Фогес-Проскауэ-

ра).

Культуры пересевают в мясо-пептонный бульон с глюкозой

(п.6.3.2.4). Посевы инкубируют при температуре 36 (+-) 1 град. Цельсия

в течение 48 ч. После инкубирования к 1 куб.см культуральной жидкости

добавляют 0,6 куб.см раствора альфа-нафтола (п.6.3.1.3) и 0,2 куб.см

раствора гидроокиси калия (400 г/куб.дм). После прибавления каждого ре-

актива пробирку встряхивают. Появление ярко-красного окрашивания не

позднее чем через 15 минут указывает на положительную реакцию образова-

ния ацетоина.

3.3.3.4. Определение подвижности.

Культуры пересевают уколом в полужидкий мясо-пептонный агар. Посе-

вы инкубируют при температуре 36 (+-) 1 град. Цельсия в течение 24 ч.

При росте подвижных культур отмечается диффузный рост по всему столбику

агара, при росте неподвижных культур - вдоль места укола.

Большинство штаммов бактерий рода Salmonella подвижны.

3.3.3.5. Определение декарбоксилирования лизина. Культуру высевают

на поверхность жидкой лизиновой среды для декарбоксилирования

(п.6.3.2.21). Посевы инкубируют при температуре 36 (+-) 1 град. Цельсия

в течение 24 ч. Появление темно-красной или фиолетовой окраски - поло-

жительная реакция, желтая окраска среды - отрицательная. Бактерии рода

Salmonella дают положительную реакцию.

3.3.3.6. Определение способности ферментировать салицин. Исследуе-

мую культуру пересевают в полужидкую среду по п.6.3.2.25. Посевы инку-

бируют при температуре 36 (+-) 1 град. Цельсия в течение 24 ч. О фер-

ментации салицина судят по изменению цвета среды, с образованием или

без образования газа. Бактерии рода Salmonella (за исключением IV груп-

пы) салицин не ферментируют.

Допускается для биохимического подтверждения принадлежности выде-

ленных культур к бактериям рода Salmonella, вместо классических мето-

дов, описанных в п.4.3.3, использовать коммерческие наборы для иденти-

фикации микроорганизмов, зарегистрированные и сертифицированные в сис-

теме государственного санитарно-эпидемиологического надзора Кыргызской

Республики.

3.3.3.7. Использование системы мультимикротестов (ММТ Е1 и ММТ Е2)

для биохимической идентификации энтеробактерий.

ММТ Е1 и ММТ Е2 - системы одноразового использования для идентифи-

кации микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae.

ММТ Е1 позволяет определить 12 ключевых ферментативных свойств эн-

теробактерий: образование сероводорода, индола, наличие лизиндекарбок-

силазы, орнитиндекарбоксилазы, уреазы, фенилаланинде-заминазы, утилиза-

цию цитрата натрия (модификация цветной реакции Симмонса), малоната

натрия, маннита, сахарозы, лактозы, сорбита.

ММТ Е2 позволяет определить 12 дополнительных биохимических

свойств, которые в сочетании с 12 ключевыми свойствами, определяемыми

ММТ Е1, служат для видовой идентификации энтеробактерий: наличие арги-

ниндегидролазы, бета-галактозидазы, нитратредуктазы, утилизацию инози-

та, дульцита, арабинозы, рамнозы, мальтозы, адонита, рафинозы, салици-

на, глюкозы.

Системы ММТ Е1 и ММТ Е2 представляют собой прозрачные полистироло-

вые 96-луночные или 48-луночные планшеты, в лунки которых помещены со-

ответствующие субстратно-индикаторные среды, стабилизированные поливи-

ниловым спиртом и стерилизованные ультрафиолетовым излучением.

Исследуемые культуры предварительно выращивают на питательном ага-

ре или на средах для первичной дифференциации (среда Клиглера, Ольке-

ницкого) в течение 12-18 часов при температуре 36 (+-) 1 град. Цельсия,

затем приготавливают из них суспензию. Исследования бактериальных куль-

тур проводят согласно инструкциям, прилагаемым к указанным системам.

Учет результатов проводят визуально с помощью приложенной к системам

таблицы через 18-24 ч инкубации.

Идентификацию проводят с помощью таблицы "Биохимическая характе-

ристика энтеробактерий с учетом данных по характеру роста, микроскопии,

источников изоляции и др., или с помощью компьютерной программы

"IDENT", разработанной НПО "Аллерген".

Результаты полученных биохимических реакций сравнивают с данными

табл. 1.

Типичными для бактерий рода Salmonella являются подвижные культу-

ры, ферментирующие глюкозу с образованием или без образования газа, не

ферментирующие лактозу и сахарозу, не образующие индол и ацетоин, обра-

зующие сероводород.

Однако установлено, что при определенных условиях сальмонеллы мо-

гут приобретать признак сбраживания лактозы. Вопрос о принадлежности

таких штаммов к бактериям рода Salmonella решается по совокупности ре-

зультатов серологических и биохимических тестов.

Если ни одна из выделенных культур не показывает типичных для бак-

терий рода Salmonella биохимических реакций, то дают заключение об от-

сутствии сальмонелл в исследуемой массе изделия.

С культурами, давшими типичные биохимические реакции согласно

табл. 1, проводят дальнейшее изучение с постановкой серологических ре-

акций.

Также серологическому исследованию подлежат:

Лактозоположительные или типичные (не более чем по одному из дру-

гих перечисленных выше биохимических признаков, исключая индол и ацето-

ин) штаммы бактерий, ферментирующие глюкозу с образованием или без об-

разования газа, которые по комплексу основных биохимических тестов мо-

гут расцениваться как подозрительные на принадлежность роду Salmonella.

3.3.4. Серологические исследования.

Серологическое исследование проводят из пробирок с суточными куль-

турами, предварительно пересеянными на поверхность скошенного мясопеп-

тонного агара или среды, приготовленной из сухого питательного агара.

Таблица 1

Условные обозначения: "+" - 90-100% штаммов положительны; "(+)" -

76-89% штаммов положительны; "(-)" - 26-75% штаммов положительны; "-" -

0-10% штаммов положительны.

Для этого петлей берут небольшое количество культуры из пробирок,

помещают на предметное стекло и добавляют каплю поливалентной адсорби-

рованной сальмонеллезной диагностической 0-сыворотки; осторожно покачи-

вают предметное стекло для получения однородной суспензии культуры.

Положительная реакция на сальмонеллы (агглютинация) наблюдается в

течение 30-60 секунд и проявляется в виде склеивания бактериальной мас-

сы и полного или частичного просветления жидкости. При отрицательной

реакции агглютинации культура в капле сыворотки сохраняется в виде го-

могенной смеси.

Обязательна постановка отрицательной реакции (культура + физиоло-

гический раствор) для выявления способности к самоагглютинации. Штаммы

бактерий, обладающие самоагглютинацией, не подвергают дальнейшему серо-

логическому тестированию.

По показаниям и при необходимости для полной типизации сальмонелл

по схеме Кауфмана-Уайта проводят постановку реакций агглютинации не

только с О-, но и с Н-сыворотками (наставление по применению агглютини-

рующих диагностических сальмонеллезных О- и Н-сывороток).

3.3.4.1. Оценка результатов.

Выделенную культуру относят к бактериям рода Salmonella, если она

показывает типичные биохимические и серологические реакции.

Предположительно относят к бактериям рода Salmonella:

- культуры, у которых не обнаружено самоагглютинации и 0-антиге-

нов, но показавших типичные биохимические реакции;

- культуры, у которых обнаружена самоагглютинация и показавших ти-

пичные биохимические реакции;

- культуры, у которых обнаружена самоагглютинация, и показавших

типичные биохимические реакции;

- культуры, у которых обнаружены не все типичные биохимические ре-

акции, но дающие положительную серологическую реакцию с одной из сыво-

роток групп A, B, C, D, E. В этих случаях констатируется присутствие

бактерий рода Salmonella в засеянной массе изделия и несоответствие его

микробиологическому нормативу.

Культуры, у которых не обнаружено самоагглютинации и не показавших

типичные биохимические и серологические реакции, не относят к бактериям

рода Salmonella, а продукты, из которых они были выделены, считают со-

ответствующими микробиологическому нормативу по этому показателю.

3.4. Определение коагулазоположительных стафилококков

(Staphylococcus aureus)

S. aureus - факультативно-анаэробные грамположительные - сферичес-

кие микроорганизмы, обладающие ферментами: коагулазой, термостабильной

ДНК-азой, кислой фосфатазой, сбраживающие маннит в анаэробных условиях,

определенная часть которых способна продуцировать энтеротоксины.

Исследования на наличие в образце коагулазоположительных стафило-

кокков проводят в соответствии с ГОСТом 10444.2-94 с учетом нижеизло-

женных рекомендаций.

3.4.1. Сущность метода.

Метод основан на способности микроорганизмов рода Staphylococcus

расти на питательных средах с повышенным содержанием хлорида натрия.

Наибольшее санитарно-гигиеническое значение имеет S. aureus (золотистый

стафилококк), принадлежность к которому, в основном, определяется по

способности коагулировать нитратную плазму крови человека или кролика и

вырабатывать фермент лецитиназу (фосфолипазу С).

3.4.2. Проведение анализа.

Для посева используют количество средней пробы продукта, подготов-

ленной по п.3.3.3, в котором предусматривается отсутствие S. aureus

(табл. 2). Посевы производят в солевой бульон с 6,5% хлористого натрия

(п.6.3.2.16). Соотношение засеваемого материала и питательной среды

должно составлять 1:10. Посевы термостатируют при температуре 36 (+-) 1

град. Цельсия в течение 24 ч. Затем со среды накопления делают пересев

петлей на подсушенные среды типа Байрд-Паркер (п.6.3.2.17) или ЖСА

(желточно-солевой агар) (п.6.3.2.19) для получения изолированных коло-

ний. Посевы помещают в термостат при температуре 36 (+-) 1 град. Цель-

сия на 18-24 ч.

На поверхности среды типа Байрд-Паркера S. aureus растут в виде

черных, блестящих, слегка выпуклых колоний диаметром 1-1,5-2 мм, окру-

женных зоной просветления среды шириной 1-3 мм (лецитиназная реакция).

На ЖСА колонии S. aureus имеют форму выпуклых дисков диаметром 2-4

мм белого, желтого, кремового, лимонного, золотистого цвета с ровными

краями, вокруг колоний образуется радужное кольцо и зона помутнения

среды.

При отсутствии типичных колоний на каждой из сред дают заключение

об отсутствии золотистых стафилококков в исследуемом количестве продук-

та и соответствии его нормативу на S. aureus.

При обнаружении на средах типа Байрд-Паркер или ЖСА подозрительных

колоний - их микроскопируют. При наличии в мазках гроздьевидных грампо-

ложительных мелких кокков из отобранных колоний (не менее трех колоний

каждого вида) делают пересев на сектора чашек Петри или в пробирки со

скошенным МПА (п.6.3.2.2), посевы выдерживают в термостате при 36 (+-)

1 град. Цельсия в течение 16-24 ч.

Из культур, выросших на МПА, после предварительной проверки мазка

на чистоту под микроскопом, ставят реакцию плазмокоагуляции.

3.4.2.1. Постановка реакции плазмокоагуляции.

В пробирку с 0,5 куб.см разведенной кроличьей плазмы (п.6.3.2.18)

вносят петлю изучаемой суточной агаровой культуры. Параллельно ставят

контроль: одну пробирку с плазмой оставляют незасеянной, а в другую за-

севают заведомо коагулазоположительный стафилококк. Все пробирки поме-

щают в термостат при температуре 36 (+-) 1 град. Цельсия. Учитывают ре-

зультаты через 1-2-4 ч и оставляют до утра при комнатной температуре

для окончательного учета. Ускорение реакции производят за счет исполь-

зования 3-х и 4-х-часовых бульонных культур стафилококков, добавляя их

по 0,1 куб.см в 0,5 куб.см разведенной нитратной плазмы. Пробирки на

свертывание плазмы следует просматривать осторожно, чтобы не разрушить

образовавшийся сгусток. При учете реакции плазмокоагуляции могут наблю-

даться три степени активности фермента коагулазы:

++++ - сгусток плотный;

+++ - сгусток, имеющий небольшой отсек;

++ - сгусток в виде взвешенного мешочка.

Все три варианта являются положительными результатами, которые

свидетельствуют о присутствии коагулазоположительных стафилококков в

засеянной массе изделия и несоответствии его микробиологическому норма-

тиву. Отрицательная реакция плазмокоагуляции свидетельствует об отсутс-

твии S. aureus в данной массе продукта.

3.5. Определение дрожжей и плесневых грибов

3.5.1 Сущность метода.

Метод основан на высеве разведений определенного количества про-

дукта в селективную среду, культивировании посевов при 24 (+-) 1 град.

Цельсия в течение 120 ч, подсчете всех видимых колоний плесневых грибов

и дрожжей, типичных по макро- и микроскопической морфологии и пересчете

их количеств на 1 г продукта.

При определении количества дрожжей и плесневых грибов необходимо

руководствоваться ГОСТом 10444.12-88 с учетом приведенных ниже рекомен-

даций.

3.5.2 Проведение анализа.

Для определения количества дрожжей и плесневых грибов выбирают те

разведения, при посеве которых на чашках вырастает не менее 15 и не бо-

лее 150 колоний для дрожжей и не менее 5 и не более 50 для плесеней.

По 1 куб.см каждого разведения образца, приготовленного по п.33,

вносят в 2 чашки Петри (параллельное определение). Затем не позже чем

через 20 мин., вносят в чашку питательную среду (п.п. 63.220-63.222),

расплавленную на водяной бане и остуженную до 45 град. Цельсия, осто-

рожно и равномерно перемешивают содержимое чашки. Высота слоя питатель-

ной среды должна быть не менее 4-5 мм. Параллельно с этим заливают одну

чашку Петри 15-20 куб.см среды для проверки ее стерильности.

После застывания среды чашки переворачивают крышками вниз и поме-

щают в термостат при 24 (+-) 1 град. Цельсия на 5 сут. Через 3 сут. до-

пускается предварительный учет типичных колоний.

Если в посевах на агаризованных средах присутствуют мукоровые,

очень быстро растущие грибы, то учет предварительных результатов необ-

ходимо проводить очень осторожно, не допуская того, чтобы споры этих

грибов осыпались и дали рост вторичных колоний. На пятые сутки проводят

окончательный учет результатов посевов. Колонии дрожжей и плесневых

грибов различают визуально.

Рост дрожжей сопровождается образованием крупных, выпуклых, блес-

тящих и без блеска, серовато-белых, розоватых, кремовых колоний с глад-

кой поверхностью и ровным краем.

Развитие плесневых грибов на питательных средах сопровождается по-

явлением мицелия различной окраски.

Для количественного подсчета отбирают те чашки, на которых выросло

15-150 колоний дрожжей и (или) 5-50 колоний плесневых грибов.

4. Микробиологические нормативы для кондитерских

изделий с кремом

В табл. 2 отражены микробиологические нормативы для кондитерских

изделий с кремом, изготовленных по традиционным технологиям (ОСТ

10-060-95) и имеющих, согласно СанПиН 42-123-4117-86 "Условия и сроки

хранения особо скоропортящихся продуктов" срок реализации от 6 до 72 ч

при хранении от 2 до 6 град. Цельсия. Эти нормативы соответствуют Сан-

ПиН 2.3.2.560-96 "Гигиенические требования к качеству и безопасности

продовольственного сырья и пищевых продуктов".

В табл. 3 отражены рекомендуемые микробиологические нормативы для

кондитерских изделий с кремом, изготовленных по усовершенствованным

технологиям в целях пролонгирования сроков годности. Указанные техноло-

гии включают усиленный входной микробиологический контроль пищевого

сырья и компонентов; применение ингредиентов только высшего качества

(например, яичного порошка, поступающего по импорту, масла сливочного с

содержанием влаги не более 16% и соответствующего по микробиологическим

показателям маслу вологодскому); в качестве консервантов - пищевых до-

бавок с антимикробным действием; а также специальных технологических

приемов для снижения бактериальной контаминации.

В табл. 4 отражены рекомендуемые микробиологические показатели для

кондитерских изделий с кремом, изготовленных по новым технологиям с ис-

пользованием специальных растительных жиров и их композиции, содержащих

насыщенные жирные кислоты, для приготовления отделочных полуфабрикатов

типа "сливок".

В одних случаях используют взбитые "сливки" на основе только спе-

циальных растительных жиров, в других случаях белковая масса начинки

производится завариванием белка куриных яиц при температуре 70-900

град. Цельсия, и в сбивную начинку растительного жира со сгущенным мо-

локом добавляют спирт.

Таблица 2

Микробиологические нормативы для готовых

изделий с кремом

Таблица 3

Микробиологические нормативы для готовых

кондитерских изделий с кремом, изготовленных

по усовершенствованной технологии, со сроками

годности - 5-7 суток при 4 (+-) 2 град. Цельсия

Таблица 4

Микробиологические нормативы для готовых изделий

с кремом, изготовленных с использованием специальных

растительных жиров и жировых композиций, содержащих

насыщенные жирные кислоты со сроками

годности 16-30 суток

Такая продукция имеет более жесткие микробиологические показатели;

сроки годности изделий, вырабатываемых по усовершенствованным техноло-

гиям и с использованием новых видов жиров, добавок и т.п., устанавлива-

ются на основе проведения обязательных комплексных санитарно-химических

и санитарно-микробиологических испытаний каждого конкретного вида про-

дукта в соответствии с требованиями МУК 4.2.2.001-03 "Гигиеническая

оценка сроков годности пищевых продуктов". Указанные нормативы и сроки

годности включаются в нормативную документацию на эти виды изделий

(технические условия) в установленном порядке.

5. Материалы, реактивы и питательные среды

5.1. Перечень средств измерений, оборудования, инвентаря, лабора-

торной посуды, материалов, реактивов и питательных сред, необходимых

для проведения микробиологических анализов, полностью приведен в ГОСТе

27543-87 "Изделия кондитерские. Аппаратура, материалы, реактивы и пита-

тельные среды для микробиологических анализов".

5.2. Сухие питательные среды для микробиологических анализов про-

мышленного производства, сертифицированные в системе ГСЭН или имеющие

НД согласованные в установленном порядке с Минздравом:

- среда для определения количества мезофильных аэробных и факуль-

тативно-анаэробных микроорганизмов - КМАФАнМ;

- питательный агар (аналог МПА и агара Хоттингера);

- питательный бульон (аналог МПБ и бульона Хоттингера);

- среда Кесслер;

- среда Эндо;

- среда Левина;

- магниевая среда;

- среда Плоскирева;

- висмут-сульфит агар;

- селенитовый бульон;

- среда Олькеницкого;

- среда Ресселя;

- среда Гисса с глюкозой;

- среда Гисса с лактозой;

- среда Гисса с сахарозой;

- среда Гисса с маннитом;

- среда Гисса с мальтозой;

- среда Гисса с сорбитом;

- среда Сабуро;

- Байрд-Паркера агар;

- агар солевой;

- бульон солевой;

- сухая цитратная кроличья плазма.

5.3. Приготовление растворов, реактивов, питательных сред

5.3.1. Приготовление растворов и реактивов.

5.3.1.1. 0,1%-ный водный раствор пептона (пептонная вода).

К 1000 куб.см дистиллированной воды добавляют 1 г пептона. После

размешивания раствор кипятят, фильтруют и разливают в пробирки, колбы и

флаконы в необходимых количествах. Стерилизуют при 121 град. Цельсия в

течение 20 мин. Раствор хранят в условиях, исключающих испарение влаги

и нарушение асептики.

5.3.1.2. Изотонический 0,85%-ный раствор хлористого натрия (физио-

логический раствор).

Для приготовления изотонического раствора с pH 6,9-7,0 используют

дистиллированную воду, pH которой проверяют индикатором бромтимолблау.

При его добавлении цвет воды должен быть бутылочно-зеленым. В иных слу-

чаях воду не используют.

В 1000 куб.см воды растворяют 8,5 г хлористого натрия, разливают

раствор в пробирки, колбы и флаконы в необходимых количествах и стери-

лизуют в течение 20 мин. при 121 град. Цельсия. Раствор хранят в усло-

виях, исключающих испарение влаги и нарушение асептики.

5.3.1.3. 5%-ный раствор анафтола.

Взвешивают 5,0 г анафтола, растворяют в 100 куб.см 96%-го этилово-

го спирта. Хранят раствор при температуре 4 (+-) 1 град. Цельсия.

5.3.1.4. Реактивы для окраски по Граму (модификация Г.П.Калины).

Реактив 1

К 1000 куб.см этилового спирта добавляют 0,5 г кристаллического

фиолетового.

Реактив 2

К 96 куб.см 0,5%-ного спиртового раствора йодистого калия добавля-

ют 2 куб.см 5%-ного спиртового раствора основного фуксина и 2 куб.см

5%-го спиртового раствора йода.

Примечание. Растворение йодистого калия в спирте рекомендуется

проводить в водяной бане при температуре 45-50 град. Цельсия при посто-

янном помешивании.

5.3.1.5. Реактив на индол (Эрлиха).

Взвешивают 5,0 г пара-диметиламинобензальдегида в стеклянном ста-

кане вместимостью 100 куб.см, помещают в коническую колбу вместимостью

200 куб.см и растворяют в 50 куб.см этилового спирта. С помощью мерного

цилиндра вместимостью 100 куб.см медленно добавляют 50 куб.см концент-

рированной соляной кислоты. Раствор хранят в колбе с притертой пробкой

при температуре 4 град. Цельсия.

5.3.1.6. Реактив на индол (Ковача).

Взвешивают 5,0 г пара-диметиламинобензальдегида в стеклянном ста-

кане вместимостью 100 куб.см, помещают в коническую колбу вместимостью

200 куб.см и растворяют в 75 куб.см изобутилового спирта. С помощью

мерного цилиндра вместимостью 100 куб.см медленно добавляют 25 куб.см

концентрированной соляной кислоты. Раствор хранят в колбе с притертой

пробкой при температуре 4 град. Цельсия.

5.3.2. Приготовление питательных сред.

5.3.2.1. Мясо-пептонный бульон (МПБ).

Говяжье мясо, освобожденное от жира и сухожилий, пропускают через

мясорубку, взвешивают, складывают в кастрюлю, смешивают с двойным коли-

чеством водопроводной воды и оставляют на 12-14 ч при температуре 4-6

град. Цельсия. Для ускорения процессов экстракции питательных веществ

содержимое кастрюли подогревают при 50 град. Цельсия в течение 1 ч и

затем кипятят 30 мин.

После кипячения бульон в горячем состоянии фильтруют через двойной

бумажный или ватно-марлевый фильтр, фильтрат измеряют и добавляют к не-

му водопроводную воду до первоначального объема, а также 1%-го пептона

и 0,5%-ной поваренной соли. После установления pH 7,2-7,4 бульон разли-

вают в колбы и стерилизуют при 121 град. Цельсия в течение 20 мин. При

необходимости бульон перед использованием фильтруют через складчатый

фильтр, разливают и повторно стерилизуют при 121 град. Цельсия в тече-

ние 15 мин.

5.3.2.2. Мясо-пептонный агар.

В 1 куб.дм мясо-пептонного бульона добавляют 15-20 г микробиологи-

ческого агар-агара. После 10-15-минутного набухания агар-агара смесь

кипятит при постоянном помешивании до полного его растворения. Получен-

ную среду после установления pH 7,2-7,4 фильтруют в горячем виде через

ватно-марлевый фильтр, разливают в колбы, флаконы и пробирки и стерили-

зуют при 121 град. Цельсия 20 мин.

5.3.2.3. Мясо-пептонный бульон (агар) с глюкозой. К 1 куб.дм мя-

со-пептонного бульона перед стерилизацией добавляют 1 г или 10 г глюко-

зы, устанавливают pH 7,0-7,2 и стерилизуют 20 мин. при 121 град. Цель-

сия.

5.3.2.4. Специальная питательная среда для определения общего ко-

личества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганиз-

мов:

питательный агар сухой - 35 г;

экстракт кормовых дрожжей - 2,5 г;

глюкоза - 1 г;

вода дистиллированная - до 1000 куб.см;

pH - 7,0;

стерилизация в автоклаве при 121 град. Цельсия в течение 20 мин.

Среда для определения количества мезофильных аэробных и факульта-

тивно-анаэробных микроорганизмов (общего количества бактерий) также вы-

пускается в сухом виде и готовится согласно прилагаемой прописи.

5.3.2.5. Среда Кесслер (с лактозой).

К 1000 куб.см водопроводной воды добавляют 10 г пептона и 50

куб.см стерильной бычьей желчи. Смесь кипятят на водяной бане при поме-

шивании 20-30 мин. Затем фильтруют ее через ватно-марлевый фильтр, до-

бавляют 2,5 г лактозы; доводят объем до 1000 куб.см. Устанавливают pH

7,4-7,6, используя 1н растворы NaOH или HCI и проверяя значение pH на

pH-метре или универсальной индикаторной бумагой. Добавляют 4 куб.см

1%-го водного раствора генцианового (кристаллического) фиолетового,

разливают в пробирки и колбы в необходимых количествах, закладывают

поплавки. Стерилизуют 15 мин. при 121 град. Цельсия.

Возможно использование сухой модифицированной среды Кесслер

(п.6.2). Подготовку среды для посева и стерилизацию проводят согласно

прописи на этикетке.

5.3.2.6. Дифференциально-диагностические среды (сухие):

висмут-сульфит агар (Вильсона-Блера);

среду Эндо;

среду Левина;

среду Плоскирева, выпускаемые в сухом виде, следует готовить сог-

ласно прописям, указанным на этикетках. Приготовленные и разлитые в

стерильные чашки Петри среды можно хранить при температуре 4 град.

Цельсия до 10 суток.

5.3.2.7. Среда на индол.

10,0 г сухого панкреатического гидролизата казеина (или 100 куб.см

жидкого панкреатического гидролизата казеина с содержанием 500 мг %

аминного азота), 5,0 г хлористого натрия, 1,0 г DL-триптофана растворя-

ют в 1000 куб.см дистиллированной воды. Доводят pH до 7,0 1н растворами

NaOH или HCI и измеряя значение pH на потенциометре или по универсаль-

ной индикаторной бумаге, разливают в пробирки по 5 куб.см, стерилизуют

15 мин. при 121 град. Цельсия.

5.3.2.8. Пептонно-буферный раствор:

калия дигидрофосфат (KH2PO4) - 0,45 г;

натрия гидрофосфат, безводный (Na2HPO4) - 5,34 г;

пептонная вода (1 г пептона + 1000 куб.см дистиллированной воды)

1000 куб.см. Приготовление: ингредиенты смешивают, разливают в пробирки

и флаконы, стерилизуют в автоклаве при 121 град. Цельсия 30 мин.

5.3.2.9. Среда Мюллера (тетратионатовый бульон Мюллера):

мел, стерилизованный - 45 г; или кальция карбонат (CaCO3), сухой

стерильный - 25 г;

мясо-пептонный бульон - 900 куб.см;

раствор Люголя - 20 куб.см;

натрия тиосульфат (Nа2S2О3 5 H2O), 50%-й стерильный раствор - 100

куб.см.

Приготовление: в стерильные флаконы помещают по 4,5 г мела, стери-

лизуют сухим жаром, после чего в каждый флакон наливают по 90 куб.см

МПБ. Стерилизуют при 121 град. Цельсия 30 мин. (pH 7,2-7,4). Затем

асептически добавляют в каждый флакон по 2 куб.см раствора Люголя и по

10 куб.см раствора натрия тиосульфата, хорошо смешивают и разливают по

пробиркам. Готовая среда стерилизации не подлежит.

Приготовление раствора Люголя:

калий йодид (KI) - 20 г;

йод кристаллический (I) - 25 г;

вода дистиллированная - 100 куб.см.

Приготовление 50%-го раствора натрия тиосульфата: в мерный цилиндр

насыпают 50 г натрия тиосульфата и добавляют воду до 100 куб.см, раст-

воряют, переливают во флакон, стерилизуют текучим паром 30 мин.

5.3.2.10. Тетратионатная среда (Мюллер-Кауфман):

среда Мюллера (стерильная) - 500 куб.см;

желчь бычья (стерильная) - 250 куб.см;

бриллиантовый зеленый (0,1%-ный водный раствор) - 50 куб.см.

Приготовление: ингредиенты смешивают, асептически разливают в сте-

рильные пробирки по 10 куб.см, дополнительно не стерилизуют.

20%-ный желчный бульон:

бульон мясо-пептонный (или Хоттингера) - 800 куб.см;

желчь бычья нативная - 200 см.

Приготовление: pH должен быть равен 7,6. Разливают по 50 куб.см во

флаконы с поплавками. Стерилизуют текучим паром три дня по 30 мин.

5.3.2.11. Магниевая среда. Среда состоит из трех растворов:

Раствор 1:

пептон - 4,2 г;

натрия хлорид (Nad) - 7,15 г;

калия дигидрофосфат (KHzPO4) - 1,48 г;

дрожжевой диализат - 9 куб.см;

вода дистиллированная - 890 куб.см.

Раствор 2:

магния хлорид (MgCl) - 35 г;

вода дистиллированная

Раствор 3:

Бриллиантовый зеленый 0,5%-ный - 90

водный раствор - 0,9 куб.см.

Приготовление: Все три раствора смешивают в указанных количествах,

разливают в необходимых объемах в колбы, флаконы или пробирки, стерили-

зуют при 121 град. Цельсия 30 мин.

5.3.2.12. Селенитовый бульон.

Среду готовят из двух основных растворов: А и Б.

Раствор А состоит из 5 г пептона, 7 г безводного двузамещенного

фосфорнокислого натрия, 4 г х.ч. лактозы, 100 куб.см дистиллированной

воды pH 6,9-7,1. Раствор стерилизуют при 121 град. Цельсия 30 мин.

Раствор Б состоит из 10%-ного раствора кислого селенитокислого

натрия, приготовленного на стерильной воде. Раствор готовят непосредс-

твенно перед употреблением.

Для приготовления среды в 50 куб.см раствора А стерильно добавляют

2 куб.см раствора Б. Среду разливают в стерильные пробирки по 5-7

куб.см, но не стерилизуют, т.к. при этом выпадает осадок красного цвета

и среда становится непригодной.

Селенитовая среда выпускается также в сухом виде и готовится по

прилагаемой прописи.

5.3.2.13. Комбинированная среда по Олькеницкому:

агар питательный сухой - 25 г;

лактоза - 10 г;

аммоний-железа (II) сульфат (FeS04 (NH4)SO4 6H2O) - 0,2 г;

натрия тиосульфат (Na2S2O3 3H2O) - 0,3 г;

мочевина - 10 г;

феноловый красный (0,4% водный раствор) - 4 куб.см;

вода дистиллированная - 1000 куб.см.

Приготовление: соли предварительно растворяют в небольшом коли-

честве дистиллированной воды. Углеводы и мочевину также растворяют в

небольших объемах воды при подогревании на водяной бане. Сухой пита-

тельный агар расплавляют в оставшемся количестве воды при нагревании и

помешивании. Затем все ингредиенты соединяют, перемешивают с расплав-

ленным агаром, фильтруют через марлевый фильтр, устанавливают pH

7,2-7,4, добавляют индикатор и разливают в пробирки по 6-7 куб.см.

Среду стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 20 мин. и скашива-

ют, оставляя столбик 2-2,5 см. Готовая среда бледно-розового цвета.

Комбинированная среда по Олькеницкому выпускается также в сухом

виде и готовится по прилагаемой прописи.

5.3.2.14. Среды для идентификации:

агар Клиглера;

среда Ресселя.

Среды Гисса (среды с сахарами) выпускаются в сухом виде. Их приго-

товление указано на этикетках.

5.3.2.15. Агглютинирующие адсорбированные диагностические сальмо-

неллезные сыворотки (поливалентные О- и Н групп А, В, С, Д, Е и редких

групп).

Необходимые разведения сыворотки готовят перед использованием сог-

ласно прилагаемой инструкции.

5.3.2.16. Солевой бульон.

К 100 куб.см мясо-пептонного бульона (МПБ) с pH 7,2-7,4 в колбе

вместимостью 200 куб.см добавляют 6,5 г хлористого натрия и разливают в

пробирки по 10 куб.см. Стерилизуют в автоклаве при 121 град. Цельсия в

течение 20 мин.

5.3.2.17. Агар типа Байрд-Паркер.

30 г сухого питательного агара размешивают в 1 куб.дм дистиллиро-

ванной воды, добавляют 10 г пирувата натрия, 5 г хлористого лития, тща-

тельно перемешивают и кипятят в течение 1 мин. до полного растворения

ингредиентов. Устанавливают pH 7,2. Разливают по флаконам объемами

100-200-300 куб.см в зависимости от потребности и стерилизуют при 121

град. Цельсия 15 мин. Среда может храниться в течение месяца в условиях

холодильника. Перед употреблением в растопленную и охлажденную до 45-50

град. Цельсия среду с соблюдением правил асептики прибавляют (из расче-

та на 100 куб.см среды) 0,5 куб.см 2%-го раствора теллурита калия и 5

куб.см эмульсии яичного желтка. Среду тщательно перемешивают и разлива-

ют в чашки Петри в объеме не менее 20 куб.см на чашку. Чашки со средой

могут быть использованы в течение 24 ч, максимум 48 ч. Перед посевом

чашки со средой подсушивают в термостате общепринятым способом.

5.3.2.18. Цитратная плазма кролика.

Цитратная плазма кролика для реакции плазмокоагуляции выпускается

в сухом виде. Готовят непосредственно перед употреблением согласно про-

писи в прилагаемом наставлении.

5.3.2.19. Желточно-солевой агар (ЖСА).

Основа - солевой агар: к мясо-пептонному бульону (МПБ) с pH

7,2-7,4 добавляют 2%-ного агара и 6,5%-ного хлористого натрия, расплав-

ляют на водяной бане, при необходимости фильтруют через ватно-марлевый

фильтр, разливают мерным цилиндром по 100 куб.см в колбы вместимостью

250 куб.см и стерилизуют при 121 град. Цельсия в течение 30 мин. Полу-

чают солевой агар. Вместо МПБ можно использовать сухой питательный

агар, добавив к нему 6,5%-ного хлористого натрия.

ЖСА: на 100 куб.см стерильного расплавленного и остуженного до 45

град. Цельсия солевого агара добавляют 20 куб.см эмульсии яичного желт-

ка. После полного размешивания желточно-солевой агар разливают в сте-

рильные чашки Петри по 20-25 куб.см и хранят в холодильнике 5-7 дней.

Эмульсия яичного желтка: на дно стерильной чашки Петри помещают

куриное яйцо, которое тщательно протирают ватой, смоченной этиловым

спиртом. Стерильным пинцетом пробивают с двух противоположных сторон

яйца два отверстия. Через одно из этих отверстий из яйца полностью уда-

ляют белок, а затем, несколько увеличив отверстие, выливают желток в

стерильную колбу вместимостью 200 куб.см. Желток добавляют в колбу с

4-мя объемами стерильного физиологического раствора, затем содержимое

тщательно встряхивают до получения гомогенной массы.

5.3.2.20. Среда Сабуро (основа среды).

40 г глюкозы, 10 г пептона, 18 г агара добавляют к 1 куб.дм дис-

тиллированной воды. Смесь подогревают, периодически помешивая, до расп-

лавления составных частей, охлаждают до 45-50 град. Цельсия, устанавли-

вают pH так, чтобы после стерилизации он составлял при 25 град Цельсия

6,5 (+-) 0,1, разливают в мерные колбы и стерилизуют при 121 град.

Цельсия 15 мин. Основу среды хранят при температуре 2-6 град. Цельсия

не более 14 сут.

5.3.2.21. Среда с лизином.

10,0 г L-лизина или L-лизина монохлорида, 5,0 г пептона, 3,0 г

дрожжевого-экстракта, 1,0 г глюкозы, 0,012 г бромкрезоллового пурпурно-

го (или 0,6 куб.см 1,6%-го спиртового раствора) растворяют в 1000

куб.см кипящей дистиллированной воды, устанавливают pH таким образом,

чтобы после стерилизации он составлял при 25 град. Цельсия 6,8 (+-)

0,1. Среду разливают в узкие бактериологические пробирки по 5 куб.см и

стерилизуют при 110 град. Цельсия 30 мин. Среда имеет светло-фиолетовый

цвет. Используют в день приготовления.

5.3.2.22. Питательные среды с антибиотиками.

Среда агаризованная с левомицетином.

К 1 куб.дм основы (п.6.3.2.20) добавляют 2 куб.см раствора левоми-

цетина сукцината растворимого (для инъекций) массовой концентрацией 50

г/куб.дм или 1 куб.см раствора массовой концентрацией 100 г/куб.дм. При

использовании левомицетина массовой концентрации 5 г/дм к 980 куб.см

основы добавляют 20 куб.см раствора.

Среда агаризованная с окситетрациклином.

К 900 см основы добавляют 100 куб.см раствора окситетрациклина ди-

гидрата массовой концентрацией 1 г/куб.дм.

Среда агаризованная с окситетрациклином и гентамицином.

К 890 см основы добавляют 100 куб.см раствора окситетрациклина ди-

гидрата массовой концентрацией 1 г/куб.дм и 5 куб.см раствора гентами-

цина массовой концентрацией 10 г/куб.дм.

Среда агаризованная с антибиотиками группы пенициллина и стрепто-

мицина.

К 1 куб.дм основы добавляют 1 или 0,5 куб.см раствора антибиотика

группы пенициллина, содержащего соответственно 50000 или 100000 БД за-

тем к среде добавляют 0,4 куб.см раствора антибиотика группы стрептоми-

цина массовой концентрацией 100 г/куб.дм.

Среда агаризованная с неомицином сульфатом.

К 1 куб.дм основы добавляют 7 куб.см раствора неомицина сульфата

массовой концентрацией 50 г/куб.дм.

При использовании раствора неомицина сульфата массовой концентра-

цией 10 г/куб.дм к 965 куб.см основы добавляют 35 куб.см раствора.

5.3.2.23. Солодовое агаризованное сусло.

Солодовое сусло готовят по ГОСТу 10444.1-84.

В 1 л водопроводной воды с температурой 50 град. Цельсия вносят

250 г ячменного неферментированного солода, перемешивают и ставят на

водяную баню. В течение 30 мин. поддерживают температуру смеси 45 град.

Цельсия. Затем температуру затора медленно (не быстрее, чем на 1 град.

Цельсия в мин.) доводят до 63 град. Цельсия и эту температуру поддержи-

вают до конца осахаривания (в течение 2 ч). Осахаренный затор фильтруют

через сито, отжимают и после остывания устанавливают плотность сусла по

сахарометру 3 Б или 6 Б. Сусло разливают в колбы, добавляют 2%-го агара

и стерилизуют в автоклаве при 112 град. Цельсия в течение 30 мин. До-

пускается использование готового неохмеленного пивного сусла.

Для определения дрожжей и грибов в продуктах, сильно обсемененных

микроорганизмами, сусло при приготовлении подкисляют стерильным раство-

ром лимонной кислоты массовой концентрацией 200 г/куб.дм или стерильным

раствором молочной кислоты с объемной долей молочной кислоты 40% до pH

3,6 (+-) 0,1, при этом при приготовлении среды увеличивают количество

агара до 30 г/куб.дм.

5.3.2.24. Питательный полужидкий агар.

3,0 г мясного экстракта, 5,0 г пептона, 4-8 г агара растворяют в

1000 куб.см дистиллированной воды. Устанавливают pH таким образом, что-

бы после стерилизации он составлял 7,0 (+-) 0,1. Среду разливают в про-

бирки по 5-7 куб.см и стерилизуют при 121 град. Цельсия 20 мин.

5.3.2.25. Среда с салицином.

10,0 г пептона, 5,0 г натрия хлорида, 10 мл индикатора Андреде(1),

2-4 г агара растворяют в 1000 куб.см дистиллированной воды, устанавли-

вают pH 7,1-7,2 и стерилизуют при 121 град. Цельсия в течение 15 мин.;

к стерильной основе добавляют салицин в количестве 0,5% (5 г на 1000

куб.см основы среды) растворяют и разливают в стерильные пробирки по

3-4 куб.см и стерилизуют при 110 град. Цельсия в течение 30 мин. (или

дробной стерилизацией текучим паром два дня по 30 мин.).

(1) В качестве индикатора pH могут также быть использованы раство-

ры бромтимолового синего, фенолового красного или бромкреолового пур-

пурного.

Список литературы

1. СанПиН 2.3.2.560-96. Гигиенические требования к качеству и бе-

зопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов.

2. Методические указания по проведению санитарно-бактериологичес-

ких исследований на предприятиях, вырабатывающих кондитерские кремовые

изделия.

3. Рецептуры на торты, пирожные, кексы и рулеты. Ч. I, II, III.

4. Технологические инструкции по производству мучных кондитерских

изделий.

5. ГОСТ 5904-82. Изделия кондитерские. Правила приемки, методы от-

бора и подготовки проб.

6. ГОСТ 10444.1-84. Консервы. Приготовление растворов реактивов,

красок, индикаторов и питательных сред, применяемых в микробиологичес-

ком анализе.

7. ГОСТ 10444.2-94. Продукты пищевые. Методы выявления и определе-

ния количества Staphylococcus aureus.

8. ГОСТ 10444.12-88. Продукты пищевые. Метод определения дрожжей и

плесневых грибов.

9. ГОСТ 10444.15-94. Продукты пищевые. Методы определения коли-

чества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов.

10. ГОСТ 26668-85. Продукты пищевые и вкусовые. Методы отбора проб

для микробиологических анализов.

11. ГОСТ 26669-85. Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб

для микробиологических анализов.

12. ГОСТ 26670-91. Продукты пищевые. Методы культивирования микро-

организмов.

13. ГОСТ 27543-87. Изделия кондитерские. Аппаратура, материалы,

реактивы и питательные среды микробиологических анализов.

14. ГОСТ Р 50474-93. Продукты пищевые. Методы выявления и опреде-

ления количества бактерий группы кишечных палочек (колиформных бакте-

рий).

15. ГОСТ Р 50480-93. Продукты пищевые. Метод выявления бактерий

рода Salmonella.