Методические указания «Определение безопасности и эффективности биологически активных добавок к пище» (Утверждены постановлением Главного Государственного санитарного врача Кыргызской Республики)

ПРЕКРАТИЛ ДЕЙСТВИЕ

в соответствии со статьей 36 Закона КР

от 20 июля 2009 года № 241

"О нормативных правовых актах Кыргызской Республики"

Зарегистрировано в Министерстве юстиции Кыргызской Республики

19 марта 2004 года. Регистрационный номер 37-04

Утверждены

постановлением Главного

Государственного санитарного

врача Кыргызской Республики

от 20 февраля 2004 года № 10

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ КЫРГЫЗСКОЙ РЕСПУБЛИКИ

2.3.2. ПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ И ПИЩЕВЫЕ ДОБАВКИ

Определение безопасности и эффективности

биологически активных добавок к пище

Методические указания

МУК 2.3.2.005-03

1. Область применения

Настоящие методические указания разработаны Департаментом госсанэ-

пиднадзора Министерства здравоохранения Кыргызской Республики в соот-

ветствии с Законом Кыргызской Республики "О санитарно-эпидемиологичес-

ком благополучии населения", Положением "О государственном санитар-

но-эпидемиологическом нормировании", Положением "О государственной са-

нитарно-эпидемиологической службе Кыргызской Республики", утвержденными

постановлением Правительства Кыргызской Республики от 10.12.2001 г. №

778, с учетом МУК 2.3.2.721-98, разработанного ведущими научно-исследо-

вательскими институтами Российской Федерации.

1.1. Методические указания предназначены для органов государствен-

ной исполнительной власти и органов местного самоуправления, предприя-

тий, организаций, учреждений и иных юридических лиц (далее - организа-

ции), физических лиц без образования юридического лица, должностных лиц

и граждан, деятельность которых осуществляется в области обращения БАД,

для организаций санитарно-эпидемиологической службы Кыргызской Респуб-

лики (далее - госсанэпидслужбы Кыргызской Республики), осуществляющих

государственный и ведомственный санитарно-эпидемиологический надзор, а

также для других организаций, уполномоченных на осуществление государс-

твенного контроля за безопасностью и эффективностью БАД.

1.2. Требования, изложенные в настоящих методических указаниях в

отношении биологически активных добавок к пище, применяются на этапах

экспертизы и регистрации биологически активных добавок к пище, а также

при разработке и постановке их на производство, промышленном производс-

тве, хранении, транспортировании, закупке, ввозе в страну и реализации

(далее - при обращении БАД), при разработке нормативной и технической

документации, регламентирующей вопросы обращения БАД.

1.3. За качество, безопасность, заявленные свойства, эффективность

и рекламу выпускаемой биологически активной добавки к пище полную от-

ветственность несет производитель.

1.4. Гигиенические требования к веществам, материалам, в том числе

вспомогательным и упаковочным, контактирующим с биологически активной

добавкой к пище, устанавливаются специальными санитарными правилами и

нормами.

2. Термины и определения

Пищевые продукты - продукты, используемые человеком в пищу в нату-

ральном или переработанном виде.

Биологически активные добавки к пище - композиции натуральных или

идентичных натуральным биологически активных веществ, предназначенных

для непосредственного приема с пищей или введенных в состав пищевых

продуктов с целью обогащения рациона отдельными пищевыми или биологи-

чески активными веществами и их комплексами.

Нутрицевтики - биологически активные добавки к пище, применяемые

для коррекции химического состава пищи человека (дополнительные источ-

ники нутриентов: белка, аминокислот, жиров, углеводов, витаминов, мине-

ральных веществ, пищевых волокон).

Парафармацевтики - биологически активные добавки к пище, применяе-

мые для профилактики, вспомогательной терапии, и поддержки в физиологи-

ческих границах функциональной активности органов и систем.

Качество биологически активных добавок к пище - совокупность ха-

рактеристик, которые обусловливают потребительские свойства, эффектив-

ность и безопасность биологически активных добавок к пище.

Безопасность биологически активных добавок, к пище - отсутствие

опасности для жизни и здоровья людей нынешнего и будущих поколений.

Эубиотики - биологически активные добавки к пище, в состав которых

входят живые микроорганизмы и (или) их метаболиты, оказывающие нормали-

зующее воздействие на состав и биологическую активность микрофлоры пи-

щеварительного тракта. Пробиотики - синоним эубиотики.

3. Общие положения

3.1. Методические указания "Определение безопасности и эффектив-

ности биологически активных добавок к пище" (далее по тексту использу-

ются сокращенные термины - методические указания и БАД) устанавливают

гигиенические требования по определению безопасности и эффективности

для человека биологически активных добавок к пище и сырья для их произ-

водства, а также требования по соблюдению указанных нормативов при раз-

работке нормативной и технической документации на них и обращения БАД.

3.2. Методические указания разработаны с целью обеспечения едино-

го, научно-обоснованного подхода к оценке эффективности и безопасности

биологически активных добавок к пище на этапах разработки, экспертизы,

регистрации и обращения БАД.

3.3. Требования настоящих методических указаний должны выполняться

при разработке государственных стандартов, нормативной и технической

документации, регламентирующей вопросы обращения БАД.

Проекты нормативной и технической документации должны быть согла-

сованы с организациями госсанэпидслужбы Кыргызской Республики в соот-

ветствии с утвержденным порядком.

3.4. Санитарно-эпидемиологическая экспертиза биологически активных

добавок к пище проводится специально уполномоченными организациями в

порядке, утвержденном Министерством здравоохранения Кыргызской Респуб-

лики, на основании нормативных и методических документов Государствен-

ной системы санитарно-эпидемиологического нормирования Кыргызской Рес-

публики.

3.5. При разработке новых видов биологически активных добавок к

пище и их усовершенствовании, а также при разработке (изменении) техно-

логических процессов юридическими лицами, осуществляющими разработку,

обеспечивается обоснование их соответствия заявленным медико-биологи-

ческим эффектам, срокам годности, показателям качества и безопасности

продукции, требованиям по их соблюдению на этапах обращения, а также

методам контроля.

3.6. Разработчик новой биологически активной добавки к пище и

(или) ее производитель обязаны включить в нормативную и техническую до-

кументацию показатели ее качества и безопасности, гигиенические норма-

тивы, требования по обеспечению указанных нормативов в процессе произ-

водства, хранения, транспортирования и реализации продукции, а также

требования к ее упаковке и маркировке, сроки годности и методы контроля

качества и безопасности продукции.

3.6.1. Производство биологически активных добавок к пище должно

осуществляться в соответствии с нормативной и технической документацией

и отвечать требованиям санитарных правил и норм в области обеспечения

качества и безопасности.

3.6.2. Качество и безопасность каждой партии (серии) биологически

активных добавок к пище подтверждается производителем в удостоверении о

качестве.

3.7. Постановка на производство новых биологически активных доба-

вок к пище, производство БАД допускается только после проведения ре-

гистрации данной биологически активной добавки к пище в соответствии с

процедурой, устанавливаемой Министерством здравоохранения Кыргызской

Республики.

3.8. Постановка на производство биологически активных добавок пи-

ще, не являющихся новыми, но впервые осваиваемых на предприятии, допус-

кается только при наличии:

- регистрационного удостоверения на данные БАД;

- санитарно-эпидемиологического заключения, выданного территори-

альными центрами госсанэпиднадзора Кыргызской Республики о соответствии

условий производства санитарным правилам, и нормам, требованиям, по

обеспечению качества и безопасности БАД, установленным в технической

документации, а также регламентируемыми в "Регистрационном удостовере-

нии".

3.9. Импортируемые на территорию Кыргызской Республики биологичес-

ки активные добавки к пище должны отвечать требованиям действующих в

Кыргызской Республики санитарных правил и гигиенических нормативов, ес-

ли иное не оговорено международными соглашениями.

3.10. Безопасность и эффективность импортируемых БАД к пище опре-

деляется на основании санитарно-эпидемиологической экспертизы конкрет-

ного вида импортируемой продукции и оценке ее соответствия действующим

санитарным правилам и гигиеническим нормативам Кыргызской Республики с

учетом соответствия БАД требованиям безопасности, установленным для та-

кой продукции в стране ее происхождения.

3.10.1. Показатели качества и безопасности, гигиенические нормати-

вы, которым соответствует предполагаемый к ввозу вид БАД и которым

должна соответствовать импортируемая в страну продукция, устанавливают-

ся в Регистрационном удостоверении.

3.10.2. Организации, осуществляющие производство и поставку импор-

тируемых на территорию Кыргызской Республики биологически активных до-

бавок к пище, обязаны зарегистрировать их в порядке, установленном Пра-

вительством Кыргызской Республики.

3.11. Организации, осуществляющие деятельность в области обращения

биологически активных добавок к пище, несут ответственность за обеспе-

чение качества и безопасности БАД. Они обязаны проводить мероприятия,

направленные на выполнение требований санитарных правил и гигиенических

нормативов, технической документации по обеспечению условий производс-

тва, транспортирования, хранения и реализации БАД.

3.12. Расфасовка и упаковка биологически активных добавок к пище

должны обеспечивать сохранение их качества и безопасности на всех эта-

пах обращения продукции.

3.13. Производитель биологически активных добавок к пище, предназ-

наченных для реализации на территории Кыргызской Республики, должен вы-

пускать их маркированными в соответствии с законодательством Кыргызской

Республики и нормативной документацией, регламентирующей вопросы марки-

ровки продукций.

3.13.1. Расфасованные и упакованные биологически активные добавки

к пище должны иметь этикетки, на которых на русском языке указывается:

- наименование продукта и его вид;

- номер технических условий (для отечественных БАД);

- область применения;

- название организации-изготовителя и ее юридический адрес (для

импортируемых на территорию Кыргызской Республики продуктов - страна

происхождения и наименование фирмы изготовителя);

- вес и объем продукта;

- наименование входящих в состав продуктов ингредиентов, включая

пищевые добавки;

- пищевая ценность (калорийность, белки, жиры, углеводы, витамины,

микроэлементы);

- условия хранения;

- срок годности и дата изготовления;

- способ применения (в случае, если требуется дополнительная под-

готовка БАД);

- рекомендации по применению, дозировка;

- противопоказания к использованию и побочные действия (при необ-

ходимости);

- особые условия реализации (при необходимости).

3.13.2. Рекомендации по применению биологически активных добавок к

пище должны быть составлены на основе экспериментального изучения БАД и

клинических испытаний и содержать сведения о дозировке БАД, курсе прие-

ма препарата, противопоказаниях и побочных эффектах.

3.14. Организация, осуществляющая реализацию биологически активных

добавок к пище, обязана обеспечить условия реализации в соответствии с

согласованными при регистрации регламентами, а также санитарными прави-

лами и нормами в области обеспечения ее безопасности.

3.14.1. Не допускается реализация биологически активных добавок к

пище:

- не соответствующих санитарным правилам и нормам в области обес-

печения качества и безопасности;

- без удостоверения о качестве;

- с истекшим сроком годности;

- при отсутствии надлежащих условий реализации;

- без информации о проведении обязательной регистрации БАД;

- без этикетки, а также в случае, когда информация на этикетке не

соответствует информации, согласованной при регистрации;

- идентифицировать которые не представляется возможным.

3.15. Не допускается использование при производстве БАД к пище

растительного сырья и продукции животноводства, полученных с применени-

ем генной инженерии (трансгенных продуктов), без разрешения уполномо-

ченных на то органов государственной исполнительной власти в порядке,

установленном Правительством Кыргызской Республики.

3.16. Фирма-изготовитель должна гарантировать, что животноводчес-

кое сырье, использованное для производства биологически активных доба-

вок к пище, получено из хозяйств, не регистрировавших при новых заболе-

ваний, и свободно от других возбудителей, потенциально опасных для че-

ловека. В целях снижения риска передачи агентов прионовых заболеваний

(Bovine Spongiform Encephalopathy - BSE) через биологически активные

добавки к пище рекомендуется везде, где это возможно, запретить в ка-

честве источника биологического сырья материалы риска. Решением Комис-

сии ЕС "EU Commission Decision of Juli 30th, 1997 (97/534 ЖС)

75/320/EEC on prohibition of the use of material presenting risks as

regard of transmissible spongioforme encephalopaties" определены мате-

риалы риска:

а) череп, включая мозг и глаза, небные миндалины и спинной мозг

быков (коров) старше 12 месяцев, коз (козлов), овец (баранов) старше 12

месяцев или имеющих коренные резцы, прорезывающиеся сквозь десны;

б) селезенка овец (баранов) и коз (козлов).

При ввозе биологически активных добавок к пище, изготовленных из

сырья животного происхождения, должна приниматься во внимание эпидемио-

логическая ситуация по BSE в стране фирмы-изготовителя.

3.17. Производство, ввоз в страну, хранение, транспортирование и

реализация населению биологически активных добавок к пище, не соответс-

твующих нормативам качества и безопасности, утвержденным в установлен-

ном порядке, не допускается.

3.18. Для проведения лабораторных исследований (измерений) качест-

ва и безопасности пищевой продукции допускаются метрологически аттесто-

ванные методики, соответствующие требованиям ГОСТов 8.010-90 и

8.556-91, установленные значения показателей погрешности которых не

превышают норм погрешности по ГОСТу 27384-87, а также методики, утверж-

денные или допущенные к применению госсанэпидслужбой Кыргызской Респуб-

лики.

Для определения эффективности биологически активных добавок к пище

используются методы, указанные в данных методических указаниях.

3.19. Качество, безопасность биологически активных добавок к пище

и способность их оказывать декларируемый изготовителем эффект определя-

ются соответствием их гигиеническим нормативам, установленным СанПиН

2.3.2.560-96 "Гигиенические требования к качеству и безопасности продо-

вольственного сырья и пищевых продуктов" и настоящими методическими

указаниями.

3.20. Органолептические свойства биологически активных добавок к

пище определяются показателями вкуса, цвета, запаха и консистенции, ус-

тановленными производителем и характерными для каждого вида продукции.

3.21. Требования, которым должны соответствовать органолептические

свойства биологически активных добавок к пище, устанавливаются в норма-

тивной и технической документации на их производство.

3.22. Гигиенические нормативы включают химические соединения и би-

ологические объекты, присутствие которых в пищевой продукции не должно

превышать допустимых уровней их содержания в заданной массе (объеме)

исследуемой продукции.

3.23. В биологически активных добавках к пище регламентируется со-

держание основных действующих веществ.

3.24. При получении неудовлетворительных результатов анализа хотя

бы по одному из показателей проводят повторный анализ удвоенного объема

выборки, взятого из той же партии.

4. Порядок санитарно-эпидемиологической

экспертизы, государственной регистрации

и перерегистрации биологически активных

добавок к пище

4.1. Проведение санитарно-эпидемиологической экспертизы и регист-

рации биологически активных добавок к пище осуществляется в соответс-

твии с порядком, установленным Министерством здравоохранения Кыргызской

Республики.

4.2. Санитарно-эпидемиологическая экспертиза и регистрация биоло-

гически активных добавок к пище включает следующие процедуры:

- первичную экспертную оценку документов и материалов, характери-

зующих данную продукцию;

- определение потребности в проведении необходимых исследований;

- проведение комплекса необходимых санитарно-химических, санитар-

но-микробиологических и других видов исследований;

- экспериментальные исследования токсикологических, физиологичес-

ких и метаболических эффектов, подтверждающие заявленный профиль БАД;

- клиническую оценку эффективности;

- комплексную экспертную оценку результатов с учетом полученных в

ходе исследований данных;

- оформление регистрационного удостоверения на биологически актив-

ную добавку к пище, присвоение номера, включение в реестр.

4.3. Для проведения работ по санитарно-эпидемиологической экспер-

тизе и регистрации биологически активных добавок к пище ее производи-

тель, поставщик или полномочный представитель представляют следующие

документы:

- заявку установленной формы с указанием полных реквизитов произ-

водителя и поставщика БАД;

- акт отбора проб установленной формы, в котором указывается дата,

место отбора образцов, их количество, наименование продукции, юридичес-

кий адрес предприятия-изготовителя, дата производства БАД, фамилии,

должности и подписи лиц, отбиравших образцы;

- при наличии посредника - доверенность от производителя на прове-

дение работ по регистрации биологически активной добавки к пище с ука-

занием получателя регистрационного удостоверения и его владельца;

- образцы биологически активных добавок к пище в количестве, опре-

деленном действующим порядком экспертизы. В случае проведения токсико-

логических или клинических испытаний количество необходимых образцов

определяется дополнительно.

4.3.1. Для биологически активных добавок к пище, производимых в

Кыргызской Республике, представляются:

- нормативная или техническая документация (технические условия,

технологическая инструкция, рецептура), оформленная в соответствии с

установленной формой;

- пояснительная записка, описывающая биологически активную добавку

к пище, область ее применения, рекомендации по применению, противопока-

зания, ограничения по применению БАД при их наличии;

- потребительская этикетка или ее проект, заверенный производите-

лем;

- инструкция по применению с указанием доз, сроков и способов

употребления БАД, заверенную производителем;

- материалы (оригинальные и литературные для аналогов) по токсико-

лого-гигиенической и биологической оценке БАД и ее клинической оценке;

- санитарно-гигиеническая характеристика производства, выданная

центром госсанэпиднадзора по месту производства БАД.

4.3.2. Для импортируемых биологически активных добавок к пище

представляются:

- сертификаты качества и безопасности фирмы-изготовителя, содержа-

щие данные о показателях безопасности, ингредиентный состав и его ха-

рактеристику, сроки годности, условия хранения;

- для БАД, содержащих части растения, указывается их ботаническое

название на латинском языке и форма (экстракт, настой и т.п.);

- документы официально уполномоченного органа страны-экспортера,

подтверждающие безопасность данной продукции и ее эффективность, доку-

мент о регистрации;

- краткие сведения о технологии производства, стандарт предприятия

на выпуск БАД;

- пояснительная записка, описывающая биологически активную добавку

к пище, область ее применения, рекомендации по применению, противопока-

зания, ограничения по применению БАД при их наличии;

- потребительская этикетка или ее проект, заверенная производите-

лем;

- инструкция по применению с указанием доз, сроков и способов

употребления БАД, заверенная производителем продукции;

- материалы (оригинальные и литературные для аналогов) по токсико-

лого-гигиенической и биологической оценке БАД и ее клинической эффек-

тивности, протоколы или заверенные копии результатов клинических испы-

таний, в которых указаны учреждения, проводившие эти испытания, схема

проведения испытаний и результаты в сравнении с контрольной группой;

- гигиенический сертификат, в котором указывается, что производс-

тво данной продукции осуществляется в соответствии с национальными

и/или международными требованиями для БАД к пище (требования GMP - Good

manifacture practice, стандартам Международной организации стандартиза-

ции - ISO 9000, 9001, 9002; или Сертификата национальных и/или междуна-

родной ("EuroNett") организаций о соответствии производства БАД стан-

дартам ISO 9000-9002. Декларация фирмы изготовителя о соответствии про-

изводства указанным выше требованиям ISO может быть представлена в виде

специальных знаков на бланках фирмы.

Все материалы представляются в оригинале и (или) нотариально заве-

ренные копии, и в переводе на русский язык.

4.4. Проведение исследований, осуществляется в учреждениях и лабо-

раториях, аккредитованных в установленном порядке.

4.5. По результатам проведенной работы готовится санитарно-эпиде-

миологическое заключение.

4.6. В случае отсутствия или непредставления необходимых докумен-

тов, наличия в составе БАД неразрешенных компонентов или лекарственного

сырья, не разрешенного в Кыргызской Республике, содержания сильнодейс-

твующих компонентов, являющихся лекарственными средствами в терапевти-

ческих дозах, может быть принято решение об отказе в регистрации.

4.7. При экспертизе биологически активных добавок к пище, предназ-

наченных для детей, необходимо учитывать следующие факторы:

- БАД для детей первых трех лет жизни не должен содержать аромати-

заторы, консерванты и стабилизаторы;

- БАД для детей могут включать только биологически активные соеди-

нения, которые разрешены для использования детьми соответствующего воз-

раста.

4.8. Перерегистрация биологически активных добавок к пище осущест-

вляется в соответствии с порядком, установленным Министерством здраво-

охранения Кыргызской Республики.

4.8.1. Основанием для перерегистрации биологически активных доба-

вок к пище является:

- окончание срока действия ранее выданного регистрационного удос-

товерения;

- изменение формы выпуска БАД;

- изменение области применения и рекомендаций по использованию

БАД;

- изменение наименования, смена торговой марки фирмы-изготовителя;

- изменение гигиенических требований к БАД;

- изменение противопоказаний и ограничений по применению БАД;

- внесение изменений в нормативную и техническую документацию на

БАД.

4.8.2. Для перерегистрации БАД ее производитель, поставщик или

полномочный представитель представляет:

- заявку на перерегистрацию биологически активной добавки к пище с

пояснительной запиской о причинах перерегистрации БАД до окончания сро-

ка действия "Регистрационного удостоверения";

- документы в соответствии с перечнем, установленным для регистра-

ции БАД;

- промышленные образцы БАД;

- копию ранее выданного "Регистрационного удостоверения".

4.8.3. Для внесения изменений в область применения и рекомендации

по использованию БАД необходимо представление данных клинико-эпидемио-

логических исследований, выполненных по программам, утвержденным в ус-

тановленном порядке.

4.9. По итогам экспертизы уполномоченным учреждением Министерства

здравоохранения Кыргызской Республики готовится регистрационное удосто-

верение или мотивированный отказ в адрес заявителя.

4.10. В случае обращения по поводу перерегистрации БАД, связанного

с изменением или увеличением числа фирм-поставщиков, уполномоченным уч-

реждением Министерства здравоохранения Кыргызской Республики, в поряд-

ке, установленном Минздравом Кыргызской Республики, выдается документ,

подтверждающий право поставки и реализации данной БАД на территории

Кыргызской Республики. Вышеуказанный документ выдается только при нали-

чии доверенности от фирмы-изготовителя, подтверждающей права фирмы-пос-

тавщика на право распространения данной БАД.

4.11. При выдаче "Регистрационного удостоверения" на отечественный

БАД, уполномоченное учреждение Министерства здравоохранения Кыргызской

Республики направляет информацию в территориальный центр госсанэпиднад-

зора по месту его производства (разработки) для осуществления госсанэ-

пиднадзора за соблюдением установленных требований при обращении БАД.

5. Санитарно-эпидемиологическая характеристика

производства биологически активных добавок к пище

5.1. Санитарно-эпидемиологическая оценка производства биологически

активных добавок к пище осуществляется с целью проверки соответствия

условий производства БАД действующим санитарным правилам и гигиеничес-

ким нормативам, организации производственно-технологического контроля

за качеством и безопасностью сырья и готовой продукции.

5.2. Санитарно-эпидемиологическая оценка производства БАД к пище

осуществляется Департаментом госсанэпиднадзора Минздрава Кыргызской

Республики и территориальными центрами госсанэпиднадзора (далее - ГСЭН)

по месту производства БАД.

5.3. При проведении санитарно-эпидемиологической оценки произ-

водств, расположенных на территории Кыргызской Республики, учитываются:

- наличие на предприятии необходимых условий для производства дан-

ного вида и объема БАД;

- возможное неблагоприятное влияние работы предприятия на условия

проживания населения или на окружающую среду (рассматриваются: заключе-

ние по отводу земельного участка, санитарно-эпидемиологическое заключе-

ние по проекту строительства или реконструкции, вопросы очистки терри-

тории);

- состояние условий труда работающих на предприятии, соблюдение

правил личной гигиены персоналом, наличие медицинской документации пер-

сонала;

- организация производственного контроля на предприятии за качест-

вом исходного сырья, технологией производства и показателями безопас-

ности конечной продукции;

- соответствие набора производственных помещений технологии произ-

водства данного вида БАД.

5.4. При проведении санитарно-эпидемиологической оценки произ-

водств, расположенных за пределами Кыргызской Республики, учитываются:

- наличие на предприятии необходимых условий для производства дан-

ного вида БАД;

- осуществление производственного контроля за качеством исходного

сырья, технологией производства и показателями безопасности конечной

продукции;

- соответствие выпускаемой продукции требованиям санитарных правил

и норм, действующих на территории Кыргызской Республики.

5.5. По результатам санитарно-эпидемиологической оценки производс-

тва представляется заключение о соответствии условий производства БАД к

пище требованиям санитарного законодательства Кыргызской Республики.

6. Порядок осуществления контроля

за производством и реализацией БАД

6.1. За соответствием качества и безопасности биологически актив-

ных добавок к пище гигиеническим нормативам должен осуществляться про-

изводственный контроль, государственный и ведомственный санитарно-эпи-

демиологический надзор.

6.2. Производственный контроль за соблюдением гигиенических норма-

тивов качества и безопасности биологически активных добавок к пище осу-

ществляют организации, действующие в сфере производства данной продук-

ции. Порядок проведения производственного контроля определяется органи-

зацией в соответствии с требованиями нормативной и технической докумен-

тации по рабочим программам и технической документации, согласованным с

центрами госсанэпиднадзора Кыргызской Республики.

6.3. Государственный санитарно-эпидемиологический надзор за ка-

чеством и безопасностью биологически активных добавок к пище осущест-

вляют органы госсанэпидслужбы Кыргызской Республики, ведомственный са-

нитарно-эпидемиологический надзор - организации санитарно-эпидемиологи-

ческих служб республиканских органов исполнительной власти, на которые

санитарным законодательством Кыргызской Республики возложены эти функ-

ции.

6.4. Организация производства биологически активных добавок к пище

осуществляется при наличии санитарно-эпидемиологического заключения

территориального ЦГСЭН о соответствии условий действующим требованиям

санитарного законодательства и согласованным при регистрации регламен-

там, а также утвержденным и согласованным с органами госсанэпидслужбы

Кыргызской Республики рабочим программам производственного контроля.

6.5. Центры госсанэпиднадзора Кыргызской Республики осуществляют

контроль за условиями производства и реализации БАД, соответствием эти-

кетки нa готовой продукции установленным требованиям и информации, за-

ложенной в регистрационном удостоверении, проводят выборочный отбор

проб и лабораторные исследования соответствия БАД установленным требо-

ваниям качества и безопасности, осуществляют контроль за условиями про-

изводства, поставки, хранения и реализации БАД.

6.5.1. По заявке производителя БАД, а также в соответствии с пору-

чениями Департамента госсанэпиднадзора Минздрава Кыргызской Республики

и территориального центра Госсанэпиднадзора Министерства здравоохране-

ния Кыргызской Республики осуществляют оценку состояния производства и

производственно-технологического контроля качества и безопасности сырья

и готовой продукции на функционирующих производствах, предполагаемых к

открытию, применительно к производству БАД с составлением санитар-

но-эпидемиологического заключения.

6.5.2. Осуществляют госсанэпиднадзор на производстве, при хранении

на оптовых и розничных предприятиях, в торговле за соблюдением:

- условий производства, технологического и лабораторного контроля

качества и безопасности сырья;

- условий хранения;

- порядка реализации информации, выносимой на этикетку (соответс-

твие ее данным "Регистрационного удостоверения"), соответствия рекламы

БАД информации, согласованной при регистрации (по данным "Регистрацион-

ного удостоверения").

6.5.3. Проводят выборочный отбор проб и лабораторные исследования

соответствия БАД установленным требованиям качества и безопасности.

6.5.4. При выявлении нарушений принимают меры в соответствии с За-

коном Кыргызской Республики "О санитарно-эпидемиологическом благополу-

чии населения".

6.5.5. Направляют информацию в Департамент госсанэпиднадзора Ми-

нистерства здравоохранения Кыргызской Республики о выявленных нарушени-

ях, принятых мерах и результатах проведенной работы.

6.6. Биологически активные добавки к пище, качество которых не со-

ответствует гигиеническим нормативам, изымаются из обращения их вла-

дельцем, а также по постановлению организаций, осуществляющих госсанэ-

пиднадзор, и не подлежат реализации по целевому назначению. Изъятые БАД

могут быть использованы в иных целях, утилизированы или уничтожены.

Удостоверение отзывается в установленном порядке.

6.7. Обоснование возможных способов и условий использования, ути-

лизации или уничтожения биологически активных добавок к пище проводится

их владельцем по согласованию с органами, вынесшими постановление об их

изъятии.

6.8. Использование, утилизация или уничтожение изъятой продукции

осуществляется их владельцем или организацией (физическим лицом), кото-

рой владелец передает по договору выполнение этих работ.

6.9. Изъятая продукция до ее использования, утилизации или уничто-

жения подлежит хранению в отдельном помещении (резервуаре), на особом

учете, с точным указанием ее количества, способов и условий использова-

ния, утилизации или уничтожения. Ответственность за сохранность такой

продукции несет владелец.

6.10. Биологически активные добавки к пище, подлежащие уничтоже-

нию, должны быть подвергнуты денатурации, способы, сроки и условия про-

ведения которой определяются в каждом конкретном случае их владельцем

по согласованию с организациями госсанэпиднадзора.

6.11. Владелец БАД представляет в органы, вынесшие постановление

об изъятии, акт об ее использовании, утилизации или уничтожении.

6.12. Организации, осуществляющие государственный санитарно-эпиде-

миологический надзор, вынесшие постановление об изъятии из обращения

биологически активных добавок, осуществляют контроль за ее использова-

нием, утилизацией или уничтожением.

7. Оценка БАД по санитарно-химическим

показателям безопасности

Все санитарно-химические показатели БАД должны соответствовать

нормам, указанным в "Гигиенических требованиях к качеству и безопаснос-

ти продовольственного сырья и пищевых продуктов" СанПиН 2.3.2.560-96

(127).

8. Санитарно-микробиологический контроль

безопасности и качества биологически

активных добавок к пище

8.1. Биологически активные добавки к пище из растительного сырья,

из сырья животного происхождения, поликомпонентные добавки с

включением витаминов, микроэлементов, минерального сырья и

т.д.

8.2. Биологически активные добавки к пище с эубиотическим

действием на основе чистых культур микроорганизмов

Название микроорганизма эубиотика в нормативной документации и в

этикетной надписи должно быть указано на латинском языке с обозначением

рода и вида микроорганизма.

8.3. Биологически активные добавки к пище смешанного состава

(культуры эубиотиков, добавки различных нутриентов)

Конкретные микробиологические нормативы для различных групп биоло-

гически активных добавок к пище приведены в "Гигиенических требованиях

к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов"

СанПиН 2.3.2.560-96 (127).

9. Радиологические показатели безопасности

Согласно "Гигиеническим требованиям к качеству и безопасности про-

довольственного сырья и пищевых продуктов" СанПиН 2.3.2.560-96 для био-

логически активных добавок к пище, в состав которых входит растительное

сырье, определяются радиологические показатели безопасности.

Радиационная безопасность БАД к пище, загрязненной другими радио-

нуклидами, определяется соответствием ее нормативам ГН 2.6.1.054-96

"Нормы радиационной безопасности (НРБ-96)".

10. Нутрицевтики

Биологически активные добавки к пище подразделяются на нутрицевти-

ки и парафармацевтики (134). Нутрицевтики - биологически активные до-

бавки к пище, применяемые для коррекции химического состава пищи чело-

века, смысл применения которых заключается в том, чтобы довести содер-

жание естественных эссенциальных макро- и микронутриентов до уровня их

содержания в суточном рационе, соответствующем физиологической потреб-

ности здорового человека в них. В этой связи нутрицевтики - источники

витаминов, полиненасыщенных жирных кислот, макро- и микроэлементов, пи-

щевых волокон, других пищевых веществ в большем числе случаев не нужда-

ются в оценке их профилактической эффективности в эксперименте или в

клинических наблюдениях, поскольку при экспертной оценке рецептур этих

продуктов, заключение о возможной их эффективности эксперт может стро-

ить на основе общеизвестных литературных данных и учете рекомендованных

доз компонентов нутрицевтика в сравнении с физиологической суточной

потребностью в них здорового человека. Нутрицевтики подвергаются полной

схеме исследований на определение в них декларируемых величин пищевых

веществ и показателей безопасности.

Функциональная роль нутрицевтиков направлена на:

- восполнение дефицита эссенциальных пищевых веществ;

- направленные изменения метаболизма веществ;

- повышение неспецифической резистентности организма к действию

неблагоприятных факторов окружающей среды;

- иммуномодулирующее действие;

- связывание и выведение ксенобиотиков;

- лечебное питание.

Конечной целью использования нутрицевтиков является улучшение пи-

щевого статуса человека, укрепление здоровья и профилактика ряда забо-

леваний.

При проведении оценки безопасности и эффективности необходимо оп-

ределить долю (в процентах) от суточной потребности, которая обеспечи-

вается нутриентами, входящими в состав предлагаемой биологически актив-

ной добавки к пище при рекомендуемой дозе приема.

Этикетка маркируется лишь теми величинами, значения которых превы-

шают 5% (витамины и макро- и микроэлементы) или 2% (другие пищевые ве-

щества и энергия). Содержание витаминов не должно превышать суточную

потребность более чем в три раза для витаминов А, Д, B1, В2, В6, В12,

ниацина, фолиевой кислоты, пантотеновой кислоты, биотина и не более чем

в 10 раз - для витаминов Е и С(*).

Средневзвешенные нормы физиологических

потребностей в пищевых веществах и энергии

10.1. Типовая схема экспериментальной модели на лабораторных

животных оценки эффективности нутрицевтиков

В случае, если эффективность нутрицевтика не доказана, проводятся

экспериментальные исследования, на лабораторных животных. Типовая мо-

дель таких исследований представлена в таблице.

Описание групп животных:

контроль - животные находятся на полноценном общевиварном или син-

тетическом рационе;

опыт-1 - модель дефицита изучаемого нутриента;

опыт-2 - модель дефицита изучаемого нутриента на фоне введения в

рацион изучаемого нутрицевтика;

опыт-3 - животным вместе с кормом вводится испытываемый нутрицев-

тик в агравированной дозе.

Забой животных проводится через 1-2 месяца от начала введения ис-

пытуемого нутрицевтика. Проводится оценка интегральных показателей сос-

тояния животных (внешний вид, активность, масса тела, абсолютная и от-

носительная масса внутренних органов). Специальные биохимические, гема-

тологические, иммунологические и морфологические методы исследования в

зависимости от состава испытуемого нутрицевтика изложены в приложениях.

11. Парафармацевтики

Парафармацевтики - биологически активные добавки к пище, применяе-

мые для профилактики, вспомогательной терапии и поддержки в физиологи-

ческих границах функциональной активности органов и систем.

Суточная доза парафармацевтика или, в случае композиции, суточная

доза действующего начала парафармацевтика, не должна превышать разовую

терапевтическую дозу, определенную при применении этих веществ в ка-

честве лекарственных средств, при условии приема БАД не менее двух раз

в сутки.

Все растения, входящие в состав парафармацевтика, должны быть про-

верены по отечественной и международной нормативной документации в пла-

не разрешения их применения в пищевой промышленности, а также в составе

лекарственных чаев и сборов в соответствии с требованиями Фармацевти-

ческого комитета Кыргызской Республики и требованиями международных

стандартов.

12.1. Показатели подлинности некоторых лекарственных растений,

входящих в состав парафармацевтиков, и методы их определения

Растения, оказывающие влияние на центральную

нервную систему

Растения, применяемые при атеросклерозе

Растения, содержащие вещества, обладающие

общеукрепляющим и противовоспалительным действием

Растения, оказывающие влияние на

пищеварительную систему

Растения, содержащие горечи

Растения, обладающие слабительными,

закрепляющими и вяжущими свойствами

Растения, обладающие диуретическими свойствами

Сокращения: Б - биологический, БХ - бумажная хроматография, В -

весовой, ГЖХ - газожидкостная хроматография, ВЭЖХ - высокоэффективная

жидкостная хроматография, СФ - спектрофотометрия, ФЛ - флуориметрия,

ХСФ - спектрофотометрический анализ с предварительным хроматографичес-

ким разделением образца, ТСХ - тонкослойная хроматография, П - полярог-

рафия, ПТ - потенциометрическое титрование, Т - титрование, ХМС - хро-

мато-масс-спектрометрия, КЦР - качественная цветная реакция.

12.2. Экспериментальное изучение функциональной активности

парафармацевтиков

Физиологический уровень содержания действующих начал многих пара-

фармацевтиков в клетках и тканях организма не известен (например, био-

генные амины, олигопептиды, гликозиды, органические кислоты, сапонины и

др.), равно как и не известна физиологическая потребность в них взрос-

лого здорового человека. Более того, у достаточно большого количества

таких БАД вообще не идентифицированы активные компоненты, т.е. действу-

ющие начала. Примером таких соединений могут служить экстракты, получа-

емые из сложных комплексов пищевых и лекарственных растений и других

видов природного сырья. Отсутствие нормы количественного содержания в

организме, действующих веществ парафармацевтиков, а также физиологичес-

кой потребности в них, в ряде случаев вызывает необходимость оценки их

действия на организм в целом или отдельные его системы и органы, т.е.

возникает задача исследования функциональной активности парафармацевти-

ков.

Назначение парафармацевтиков, состоящих из лекарственных растений

с высоким уровнем содержания высокоактивных действующих начал без четко

установленных доз и четкого знания механизмов действия, в ряде случаев

может привести к тому, что реакции компенсаторно-адаптационного харак-

тера могут оказаться неадекватными: более сильными, чем нужно, или ос-

лабленными. Это может стать причиной развития последующих патологичес-

ких изменений в организме. Так, например, если при общем адаптационном

синдроме секреция глюкокортикоидов окажется чрезмерной, они будут угне-

тать развитие иммунологических, неспецифических защитных реакций (вос-

паление), и тогда резко повышается риск развития огромного числа забо-

леваний, связанных с недостаточной функциональной активностью иммунной

системы (135).

Целью данного раздела методических указаний является выявление

влияния БАД-парафармацевтиков на показатели систем, участвующих в меха-

низмах развития компенсаторно-приспособительных реакций, на основании

которых можно, было бы судить, в конечном счете, об эффективности неко-

торых видов БАД-парафармацевтиков, которая в большинстве случаев заклю-

чается в их профилактическом (в отношении развития патологических про-

цессов) или общеукрепляющем действии.

Основные отличия БАД-парафармацевтиков от лекарств

а. БАД-парафармацевтики в большинстве случаев являются источниками

природных компонентов пищи, не обладающих питательной ценностью, однако

относящихся к незаменимым факторам питания - органическим компонентам

пищевых и лекарственных растений, продуктов моря и компонентов животных

тканей. Реже действующие начала БАД-парафармацевтиков могут быть полу-

чены биотехнологическими или химическими способами. К БАД-парафармацев-

тикам относятся и продукты, приготовленные на основе композиций микро-

организмов, предназначенные для нормализации и поддержания микробиоце-

ноза кишечника (эубиотики/пробиотики). Действующие начала БАД-парафар-

мацевтиков специфически поддерживают или регулируют в физиологических

пределах функции отдельных органов и систем. Применяются исключительно

"per os". Реализуются в свободной продаже как через специальные отделы

продовольственных магазинов, так и через отделы безрецептурных средств

аптек. При использовании БАД-парафармацевтиков в качестве вспомогатель-

ных средств при диетотерапии заболеваний человека или в качестве специ-

фических профилактических средств перед их применением необходима кон-

сультация врача-специалиста.

б. Эффект БАД-парафармацевтиков реализуется путем инициации уни-

версальных механизмов адаптационно-приспособительных реакций организма

на воздействие раздражителей самой различной природы.

в. Количественные изменения параметров функционирования систем и

органов организма лежат в пределах их физиологической нормы.

г. Широкий (гораздо более чем у лекарств) диапазон используемых

доз, при которых БАД-парафармацевтики оказывают свое нормализующее и

корректирующее действие на функции отдельных органов и систем организма

человека при отсутствии токсичных и побочных эффектов.

Принципы экспериментального изучения БАД-парафармацевтиков

а. Учитывая комплексность и плейотропность физиологических эффек-

тов БАД-парафармацевтиков при изучении их эффективности, предпочтение

следует отдавать экспериментальным моделям "in vivo".

б. Исходя из абсолютной предопределенности алиментарного пути пос-

тупления пищевых веществ, все изучаемые БАД-парафармацевтики должны

вводиться при их экспериментальной оценке "per os".

в. Тестированию следует подвергать готовую к применению форму

БАД-парафармацевтика, а не отдельные компоненты, входящие в ее состав,

на уровне доз, рекомендованных для человека (используя общепринятые для

этого в токсикологии и фармакологии методики пересчета, в т.ч. на кг

массы тела).

г. При оценке действия БАД-парафармацевтиков необходимо исследо-

вать их влияние на системы, участвующие в формировании реакций острой

фазы или общих механизмов реализации адаптационного синдрома.

Основные методические подходы к экспериментальной оценке

эффективности БАД-парафармацевтиков

Большое разнообразие адаптационных неспецифических защитно-приспо-

собительных реакций организма на раздражители различного рода крайне

затрудняет оценку функциональной активности БАД-парафармацевтиков на

системы сохранения динамического гомеостаза организма. Однако, как из-

вестно, все системы, участвующие в реакциях острой фазы, тесно связаны

друг с другом посредством различного рода медиаторов, пептидов, гормо-

нов, трофических факторов, лимфокинов через соответствующий рецепторный

аппарат (136). Иными словами, любое изменение одной системы обязательно

приводит к изменениями других системах. В этой связи выбор исследуемых

систем диктуется набором преимущественных эффектов БАД-парафармацевти-

ка.

Как известно, основным эффектом БАД-парафармацевтиков является по-

вышение резистентности организма к инфекциям, стрессорным, агрессивным

воздействиям химической и физической природы. Такие эффекты БАД-пара-

фармацевтиков в большинстве случаев обусловлены положительным влиянием

их на различные звенья иммунной и детоксикационной систем организма и

другие общие механизмы адаптационно-приспособительных реакций, в т.ч.

за счет поддержания функции антиоксидантных систем организма.

Вышеизложенное позволяет констатировать, что оптимальная схема оп-

ределения функциональной активности БАД-парафармацевтиков должна вклю-

чать изучение их влияния на систему иммунитета, резистентность к стрес-

сорным воздействиям разнообразной природы (физическая нагрузка, дли-

тельный стресс, химические и т.д.) и на окислительно-антиокислительный

статус организма. Правильность именно такого подхода к эксперименталь-

ной оценке эффективности БАД-парафармацевтиков вытекает из известных и

многократно доказанных учеными разных стран фактах о том, что поражение

именно этих систем лежит в основе наиболее распространенных заболеваний

человека. Взаиморегуляция нервной, иммунной и окислительно-антиокисли-

тельной систем определяет надежность их совместной деятельности. Нару-

шение же функциональной активности одной из этих систем резко повышает

риск развития функциональных расстройств общих механизмов защитно-прис-

пособительных реакций на воздействие факторов окружающей и внутренней

среды организма человека. Так, например, нарушение нейрорегуляторных

механизмов реализации адаптационного синдрома может играть важную роль

в патогенезе иммунологических расстройств и дизрегуляции радикальных

окислительных процессов, а иммунологические механизмы, в свою очередь,

могут участвовать в патогенезе заболеваний центральной нервной системы

и формировании окислительного стресса (136).

Учитывая это, для большей информативности и удешевления исследова-

ний эффективности БАД-парафармацевтиков следует использовать унифициро-

ванные экспериментальные модели. Примером может служить модель истощаю-

щей физической нагрузки, которая кроме непосредственного изучения адап-

тогенного действия БАД-парафармацевтика дает возможность исследования

его влияния на показатели иммунной (ФИО, ИЛ-2) и окислительно-антиокис-

лительной (МД, каталаза) систем. Использование данной модели позволяет

установить функциональную, энантиостатическую безопасность(*) (Mangum,

Towle, 1977) БАД-парафармацевтиков для здоровья человека, тем самым

предопределяя обязательность такого рода исследований.

(*) Энантиостатическая безопасность - поддержание функции.

В случае, когда назначение БАД-парафармацевтика предполагает нали-

чие какого-либо преимущественного эффекта или эффектов (радиопротектор-

ного, иммуномодулирующего, антиоксидантного и т.д.) необходимо дополни-

тельное изучение активности таких БАД в экспериментах, моделирующих со-

ответствующие нарушения.

Так, для определения специфических эффектов БАД-парафармацевтиков

можно использовать следующие методические подходы:

- радиопротекторного действия БАД-парафармацевтиков - мышей облу-

чают сублетальными дозами рентгеновского излучения (200-300 Рад) и изу-

чают влияние БАД на показатели иммунной системы, с добавлением методов

оценки пролиферативной и антителообразующей активности клеток селезенки

и ОАО системы;

- иммуномодулирующего действия БАД-парафармацевтиков - мышам вво-

дят циклофосамид или циклоспорин А (применение того или иного иммуно-

депрессанта определяется преимущественным действием БАД на конкретное

звено иммунной реакции) и изучают влияние БАД на показатели иммунной

системы с добавлением методов определения пролиферативной и антителооб-

разующей активности клеток селезенки мыши;

- ампиоксидантного действия - мышам вводят раствор четыреххлорис-

того углерода и изучают показатели ОАО системы, с добавлением методов

определения диеновой коньюгации ПНЖК и гидроперекиси липидов;

- резистентности к инфекциям - мышей заражают штаммом S. typhi и

изучают показатели иммунной системы с добавлением метода определения

неспецифической резистентности к инфекциям;

- изучение адаптогенного действия парафармацевтиков проводят на

стандартных моделях различных экстремальных условий (повышенная физи-

ческая нагрузка, гиподинамия), а также исследуют эмоциональные поведен-

ческие реакции животных.

Лабораторные животные

Для изучения функциональной активности БАД-парафармацевтиков раз-

личной природы используют мышей-самцов линии CBA/CaLacSto. Количество

животных в опытной группе следует определять с учетом используемой мо-

дели исследования, кратности обследования животных и подсчета, статис-

тически достоверных результатов (137). В качестве контроля используют

группу здоровых интактных мышей той же линии.

Модель истощающей физической нагрузки

Влияние на общую физическую выносливость следует определять на мы-

шах с помощью стандартной методики - плавания животных в бассейне с

температурой воды (20 (+-) 0,5) град. Цельсия. Для уменьшения вариа-

бельности получаемых результатов к каждой мыши подвешивают груз (5% от

массы тела), не затрудняющий движения животного.

Исследуемую добавку вводят животным внутрижелудочно за 40 мин. до

помещения их в бассейн. Контрольным животным вводят тот же объем дис-

тиллированной воды или физиологического раствора. Продолжительность

плавания регистрируют в секундах. Контрольную и опытную группы животных

делят на две подгруппы. Первую подгруппу мышей забивают сразу же после

проведения опыта, выделяют селезенку (для изучения иммунной системы),

печень и эритроциты (для изучения ОАО системы). Вторую подгруппу живот-

ных забивают спустя 1 ч после опыта и также выделяют селезенку, печень

и эритроциты для изучения темпов восстановления исследуемых показателей

(138).

Изучение адаптогенного действия БАД-парафармацевтиков

Общие положения

В развитии адаптационных реакций, которые являются ответом на зна-

чительную физическую, стрессорную, гипоксическую или любую другую наг-

рузку выделяют два этапа: этап срочной, но несовершенной адаптации и

последующий этап относительно устойчивой и достаточно совершенной дол-

говременной адаптации (139). Срочный этап адаптационной реакции возни-

кает непосредственно после начала действия раздражителя и, следователь-

но, может реализоваться лишь на основе готовых, ранее сформировавшихся

биологических механизмов. Важнейшая черта этого этапа адаптации состоит

в том, что деятельность организма протекает на пределе его физиологи-

ческих возможностей при полной мобилизации функционального резерва - и

далеко не в полной мере обеспечивает необходимый адаптационный эффект.

Другим неотъемлемым компонентом срочной адаптации при достаточно интен-

сивном действии патологических факторов окружающей внутренней среды ор-

ганизма человека является значительная стресс-реакция со всеми ее про-

явлениями, т.е. увеличением концентрации катехоламинов, кортикостерои-

дов, медиаторов, эозинопенией и т.д. Наконец, существенным компонентом

срочной адаптации может оказаться более или менее выраженное поврежде-

ние организма, проявляющееся отрицательным азотистым балансом, увеличе-

нием пероксидации липидов, ферментемией и т.д. (139).

Долговременный этап адаптации возникает постепенно в результате

длительного или многократного действия на организм факторов среды. По

существу он развивается на основе многократной реализации срочной адап-

тации и характеризуется тем, что в итоге постепенного количественного

накопления каких-то изменений организм приобретает новое качество.

Таким образом, в зависимости от продолжительности действия патоло-

гического фактора, адаптация может быть кратковременной или долговре-

менной (140).

Специфичность адаптации проявляется в реакциях доминирующих сис-

тем, т.е. функциональных систем организма, изменение функции которых

обеспечивает гомеостаз под влиянием изменяющихся условий существования

(141). Доминирующими, системами могут быть системы различных видов

нервной деятельности, транспорта жидких тканей, газов и метаболитов,

мышечного сокращения, кислотно-щелочного состояния, терморегуляции, го-

меостаза, иммунитета и т.д. В функциональной системе, ответственной за

адаптацию различают эффекторную и управляющую части (142).

Эффекторная часть представлена выполняющими специализированную

функцию элементами (субсистемными, структурно-функциональными единицами

органов, тканями, клетками, ультраструктурами, метаболическими путями).

Управляющая часть состоит из центрального и периферического звеньев

нейрогуморальной регуляции (Данное разграничение довольно условно, так

как механизмы, распределяющие каскады метаболических реакций между эф-

фекторной и управляющей частями недостаточно изучены). Эффекторная

часть определяет специфическую функцию (например, повышение физической

выносливости и работоспособности за счет возбуждения соответствующих

моторных центров, мобилизации скелетных мышц, а также кровообращения и

дыхания). Управляющая часть обеспечивает адаптивное изменение специали-

зированной функции клетки путем ее мобилизации или перевода в неактив-

ное состояние, новообразования или редукции ее структурных или молеку-

лярных компонентов (например изменение эмоциональных поведенческих ре-

акций, а также иммунного и окислительно-антиокислительного статуса)

(143).

В связи с этим БАД к пище следует изучать на обе составляющие

адаптивной реакции организма к действию различных раздражителей.

Методы оценки адаптогенного действия БАД-парафармацевтиков

а. Оценка влияния БАД-парафармацевтиков на выносливость мышей к

скоростной нагрузке.

Влияние на выносливость к скоростной физической нагрузке следует

определять на 10-дорожном третбане при скорости движения полотна 40

м/мин.

Моментом окончания опыта считается пребывание животных на электри-

ческой сетке третбана под напряжением 25 В более 10 с. Опыт проводят

при двух функциональных состояниях животных: на фоне относительного по-

коя (свободного содержания животных в клетках) и на фоне предваритель-

ной физической нагрузки. Нагрузку осуществляют с помощью принудительно-

го бега животных в третбане при скорости движения ленты 28 м/мин. в те-

чение 5 мин. Животные, получившие предварительную физическую нагрузку,

разделяются на 2 подгруппы. В первой подгруппе мыши подвергаются однок-

ратной физической нагрузке в течение 5 мин. Вслед за этим животным вво-

дят изучаемую БАД и спустя 1 ч исследуют скоростную выносливость. Жи-

вотные второй группы ежедневно получают дозированную физическую нагруз-

ку в течение 7 дней. В первый день длительность бега составляет 5 мин.,

в другие дни продолжительность нагрузки последовательно увеличивают на

1 мин. Сразу же за проведением нагрузки мышам вводят изучаемую БАД. На

7-й день через 1 ч после последнего введения добавки у животных изучают

скоростную выносливость. Во всех экспериментах БАД-парафармацевтики

вводят "per os", а животным контрольных групп - дистиллированную воду в

том же объеме (138).

б. Оценка действия БАД-парафармацевтиков на переносимость животны-

ми физических нагрузок.

Влияние на переносимость физических нагрузок следует изучать, вы-

зывая у животных состояние стресса в сочетании с гиподинамией, при под-

вешивании мышей за шейную складку в течение 3-х дней по 18 ч ежедневно.

В интервале между экспериментальными "подвешиваниями" животные получают

полноценное питание в условиях вивария. Введение БАД-парафармацевтиков

осуществляется алиментарным путем. Контрольные мыши во время "подвеши-

вания" подопытных животных лишаются воды и пищи. Оценку работоспособ-

ности проводят по продолжительности бега животных в третбане при ско-

рости движения полотна 28 м/мин. (138).

в. Оценка действия БАД-парафармацевтиков на эмоциональные поведен-

ческие реакции животных.

Используют метод спровоцированных эмоциональных реакций. Изучение

свойств БАД проводят методом электростимуляции попарно сгруппированных

животных в модификации Полевого Л.Г. и Кудрина А.И. Сущность методики

заключается в возможности дифференцированно оценивать пороги эмоцио-

нальных поведенческих реакций страха и ярости (агрессивности) у мышей

путем градуального повышения напряжения электрической площадки, на ко-

торую помещают 2-х животных. Изучаемую БАД вводят за 40 мин. до посадки

животных на электрическую площадку.

Изучение иммуномодулирующего действия БАД-парафармацевтиков

Общие положения

Во всех случаях развития адаптивных реакций происходит активация

иммунной системы как конкретного звена управляющей части функциональной

системы, ответственной за адаптацию. В основе иммуноадаптивных процес-

сов лежат межклеточные взаимодействия, опосредованные гуморальными фак-

торами. Полипептидные факторы неиммуноглобулиновой природы, относящиеся

к медиаторам неиммунологических реакций, получили название цитокинов.

Подобно регуляторным субстанциям другой природы и гормонам цитокины по

характеру действия представляют собой факторы роста или дифференцирова-

ния клеток и реализуют свое действие через обычные для подобных факто-

ров механизмы. Основными цитокинами, включающими группу приспособитель-

ных реакций функциональной системы, являются медиаторы естественного

иммунитета, которые, действуя на клетки-мишени разных органов, изменяют

их функции. В результате выявляются следующие эффекты:

- в печени происходит усиление синтеза белков острой фазы (С - ре-

активный белок, гаптоглобин, церулоплазмин и т.д.) и их выделение в

кровь;

- в костном мозге стимулируется развитие нейтрофилов, что приводит

к нейтрофилии. Усиливается их хемотаксис и активируется образование

этими клетками лактоферрина;

- активируются центры терморегуляции в гипоталамусе (действие в

качестве эндогенных пирогенов);

- стимулируется катаболизм белков в мышцах. Образующиеся аминокис-

лоты поступают в печень, где они используются для синтеза белков острой

фазы и глюконеогенеза (135).

Типичным представителем группы медиаторов естественного иммуните-

та, которые непосредственно участвуют в развитии иммунной реакции на

действие раздражителя является фактор некроза опухоли - ( ) (ФНО-).

ФНО- является медиатором широкого спектра действия, посредством

которого осуществляется регуляция, функциональной активности клеток им-

мунной и воспалительной системы организма. Биологическое действие ФНО-,

подобно влиянию ЛПС, определяется его концентрационной зависимостью. В

низкой концентрации порядка 10(-9) М, действует на лейкоциты и клетки

эндотелия локально, т.е. по паракринному или аутокринному типу. В ре-

зультате ФНО- вызывает на клетках эндотелия сосудов появление новых ре-

цепторов адгезии лейкоцитов, прежде всего нейтрофилов, а затем и моно-

цитов и лимфоцитов. Усиление адгезии клеток на сосудистых стенках вызы-

вает появление очагов локального воспаления. В пределах данных очагов

лейкоциты усиливают бактериальный киллинг, а действие ФНО- на мононук-

леарные фагоциты и другие типы клеток активирует продукцию цитокинов,

включая ИЛ-1, ИЛ-6, хемокинов и самого ФНО-. Таким образом, возникает

каскад цитокиновых реакций, регулирующий активность локального иммунно-

го и воспалительного процесса. Кроме того, ФНО- обладает интерферо-

но-подобным действием, усиливает экспрессию антигенов 1 класса МНС и

цитолитическую активность Т-лимфоцитов (CD8(4)) в отношении вирус-инфи-

цированных клеток (144, 145, 146).

Другая группа медиаторов включает цитокины, регулирующие актива-

цию, рост и дифференцирование лимфоцитов. Среди них наиболее важным и

хорошо изученным медиатором является интер-лейкин-2 (ИЛ-2).

ИЛ-2 является ключевым цитокином; активирующим митотическую актив-

ность и переход клетки из фазы G 1 в фазу S. Основное количество ИЛ-2

продуцируется Т-лимфоцитами CD-4+, и гораздо меньший вклад для образо-

вания медиатора имеют Т-лимфоциты CD8+. Основными клетками-мишенями

ИЛ-2 являются сами клетки-продуценты, то есть данный медиатор выполняет

роль аутокринного фактора активации и созревания Т-лимфоцитов. Регуля-

ция роста и созревания Т-лимфоцитов, прежде всего хелперных CD-4+ лим-

фоцитов, включает механизм последовательного взаимодействия ИЛ-2 с ре-

цепторами разной аффинности. Созревание покоящихся Т-лимфоцитов, огра-

ничено действием высокой концентрации ИЛ-2, а пролиферация активирован-

ных лимфоцитов - диапазоном его низких концентраций.

Указанные взаимодействия ИЛ-2 и Т-лимфоцитов осуществляются преи-

мущественно по аутокринному типу. Однако ИЛ-2 может оказывать действие

и на клетки ближайшего окружения, выполняя функции паракринного росто-

вого фактора CD-4+ и CD-8+, Т-лимфоцитов. В период развития физиологи-

ческой иммунной реакции на антиген ИЛ-2 не поступает в кровяное русло.

Поэтому при нормальном течении иммунного ответа его действие как эндок-

ринного ростового фактора не проявляется. Локальная продукция ИЛ-2 в

зоне созревания CDr4+ и CD-8+ клеток позволяет регулировать количество

и соотношение субпопуляций Т-лимфоцитов, определяя тем самым величину

иммунного ответа на Т-зависимые антигены. Кроме того, ИЛ-2 стимулирует

В-лимфоциты и усиливает продукцию специфических антител (5, 6, 14, 21).

Таким образом, в механизмах адаптационных изменений иммунного ста-

туса организма ведущая роль принадлежит продукции таких, медиаторов им-

муногенеза, как ФНО- и ИЛ-2. В этой связи влияние БАД к пище на иммун-

ную систему следует оценивать по изменению уровня продукции иммуноком-

петентными клетками вышеупомянутых цитокинов.

Методы оценки действия БАД к пище на показатели иммунной системы

При оценке специфической активности БАД в отношении показателей

иммунной системы необходимо исследовать ее действие не только на уро-

вень секретируемых иммунокомпетентными клетками растворимых медиаторов

иммуногенеза, но и исследовать следствия изменения продукции цитокинов,

т.е. изучать клеточный и гуморальный ответ. Комплексное иммунологичес-

кое исследование необходимо для решения вопроса о сохранении функцио-

нальной полноценности иммунной системы после применения БАД.

Как известно, одним из важнейших условий формирования иммунного

ответа является пролиферация антиген-стимулированных иммунокомпетентных

клеток под действием медиаторов иммуногенеза, в частности ИЛ-2. Моделью

такой пролиферации является реакция бласттрансформации лимфоцитов

(РБТЛ) под воздействием митогенов. Митогены, конканавалин А (КонА) или

фитогемагглютинин ФГА, связываясь с рецептором клеточной поверхности,

приводят к продукции ИЛ-1 и ФНО, способствующих усилению экспрессии ре-

цептора для ИЛ-2 - основного фактора пролиферации Т-лимфоцитов. Кроме

того, ИЛ-2 стимулирует В-лимфоциты и усиливает продукцию специфических

антител. Наиболее распространенный экспериментальный подход изучения

гуморального иммунитета заключается в инициации процесса антигензависи-

мой пролиферации и дифференцирования В-лимфоцитов, являющихся предшест-

венниками антителообразующих клеток.

Для статистической обработки данных следует использовать критерий

t Стьюдента, представляя среднюю ошибку и ошибку средней (М+т) (147).

1. Оценка влияния БАД на показатели иммунной системы интактных

мышей

а. Определение влияния БАД на неспецифическую резистентность мышей

к бактериальной инфекции.

Мышам вводят перорально и внутривенно БАД в трех дозах. Контролем

служат мыши, не получавшие БАД. На каждую дозу берут по 10 мышей. Через

24 ч всех мышей внутрибрюшинно заражают штаммом S.tiphi 4446, ресуспен-

дированным в 0,5%-ном муцине или используют любую другую инфекционную

модель. Заражающая доза равна 100 LDa, оттитрованная на интактных мышах

предварительно. Гибель животных учитывается в течение 5 сут. Параллель-

но ставят контроль вирулентности используемого штамма. Через 5 сут.

подсчитывают ЕД-50 по формуле Кебера (Ашмарин И.Л., Воробьев А.А.,

1962) или любым другим статистическим методом.

Статистически значимое уменьшение значения ЕД-50 в опытных группах

свидетельствует о стимулирующем действии БАД, увеличение - о супрессив-

ном.

б. Определение уровня антител в сыворотке крови мышей к корпуску-

лярному тимусзависимому антигену.

Для определения антител в сыворотке крови мышей используют эритро-

циты барана. Иммунизируют мышей 2-х линий: С57В1 - низкореагирующие на

эритроциты барана и мышей линии СВА - высокореагирующие. Опытную группу

мышей (5 мышей) внутрибрюшинно иммунизируют 0,5 мл эритроцитами барана

(концентрация 20 млн.кл/мл). Эритроциты барана предварительно 3 раза

отмывают 0,9%-ным раствором хлорида натрия путем центрифугирования 7

мин. при 400 g и доводят до концентрации 50 млн.кл/мл. Одновременно

этой же группе животных вводят исследуемую добавку к пище в трех дозах.

Контролем служат две группы мышей: одна группа - интактные мыши, другая

иммунизирована только эритроцитами барана. Через равные промежутки вре-

мени, начиная с 4-го дня после введения препаратов, у каждой мыши берут

кровь из ретроорбитального пространства. Срок исследования - не менее

21 дня. Из крови мышей получают сыворотку, которую титруют в реакции,

прямой гемагглютинации общепринятым методом.

Подсчитывают среднеарифметическую титра гемагглютиногенов в сыво-

ротке крови опытной группы мышей. Увеличение титров гемагглютиногенов в

сыворотке-крови опытной группы мышей свидетельствует о стимулирующем

действии БАД.

в. Определение уровня антител в сыворотке крови мышей к раствори-

мому тимусзависимому антигену.

В качестве растворимого тимусзависимого антигена используют бычий

сывороточный альбумин (БСА).

Мышей иммунизируют БСА дозой 50 мкг в 0,5 мл 0,9%-ного раствора

хлорида натрия внутрибрюшинно. Исследуемые продукты вводят в трех дозах

одновременно с БСА или за 30 мин. до иммунизации БСА. Контролем служат

две группы мышей: одна группа получает только БСА (без БАД), другая ин-

тактная.

На 28 день после иммунизации проводится ревакцинация мышей той же

дозой БСА и берется кровь у мышей на 7, 14 и 21 дни после ревакцинации.

Получают сыворотку крови и исследуют ее в реакции РПГА на наличие ге-

магглютининов к БСА общепринятым методом.

Для постановки РПГА готовят эритроцитарный диагностикум. Формали-

низированные эритроциты в 50%-ной концентрации трехкратно отмывают

0,9%-ным физиологическим раствором центрифугированием при 400 g 10 мин.

После чего концентрация эритроцитов доводится до 2,5%.

На 1000 мл диагностикума берется 50 мг танина, 2 л буфера рН 7,2

(фосфатного), все смешивается и энергично встряхивается 10 мин. После

чего производится осаждение и двукратное отмывание эритроцитов на цент-

рифуге при том же режиме. Ресуспензируют фосфатным буфером (рН 6,4) до

1 л. Затем на 1000 мл эритроцитов (2,5%) добавляют 250 мг БСА, переме-

шивают и помещают в термостат на 24 ч при 37 град. Цельсия, перемешива-

ют не менее 5 раз. После инкубирования добавляют 10 мл формалина, пере-

мешивают и помещают в термостат на 30 мин. После этой процедуры отмыва-

ют физиологическим раствором (рН 7,2) два раза, затем ресуспензируют

буфером рН 7,2 с добавлением формалина так, чтобы в конечном продукте

содержалось 2,5% эритроцитов и 1% формалина. Для постановки реакции

обязательно применяется 0,9%-ный физиологический раствор, содержащий 1%

формалина.

Подсчитывают среднеарифметическую титра гемагглютиногенов в группе

и определяют их разницу по критерию Стьюдента.

Увеличение титров антител в опытных группах свидетельствует о сти-

мулирующем действии их проявления вторичного иммунного ответа БАД.

г. Определение поликлональной активности В-лимфоцитов.

Активность В-лимфоцитов определяется на модели подсчета спонтанных

"фоновых" клеток селезенки мышей, продуцирующих антитела к эритроцитам

барана (АОК) методом локального гемолиза эритроцитов в геле. Опытной

группе мышей двух линий (по три мыши) вводят БАД. На 5-7 день мышей за-

бивают, извлекают селезенки и готовят взвесь спленоцитов (концентрация

100 млн.кл/мл). Эритроциты барана отмывают 0,9%-ным раствором хлорида

натрия путем центрифугирования 7 мин. при 400 g три раза. Приготавлива-

ют 0,9%-ный раствор агара "Дифко" с раствором Хенкса, доводят рН раст-

вора до 7,2 1%-ным раствором КН Ю или NaOH по цвету индикатора, находя-

щегося в растворе Хенкса. Для приготовления 10 чашек Петри необходимо

225 мг агара, 22,5 мл дистиллированной воды и 2,5 мл раствора Хенкса. К

приготовленному раствору агара добавляют отмытые эритроциты барана из

расчета получаемой концентрации эритроцитов 20-30 млн. в 1 мл.

Полученную рабочую смесь разливают по 2,5 мл в пробирки, которые

помещают в водяную баню при температуре 43-44 град. Цельсия. В каждую

пробирку добавляют по 0,2 мл взвеси исследуемых клеток селезенки, пере-

мешивают и выливают на чашку Петри. Через 5-7 мин. чашки помещают в

термостат при температуре (37(+-)2) град. Цельсия на 1 ч, затем в каж-

дую чашку выливают по 2,5 мл разведенного в 5 раз средой 199 сухого

комплемента морской свинки (при использовании свежезамороженного комп-

лемента его разводят в 10 раз). Чашки Петри оставляют при комнатной

температуре на 30 мин. и затем подсчитывают макроскопически число зон

гемолиза в каждой чашке Петри. Рассчитывают число клеток, образующих

антитела на селезенку и на 1 млн. ядросодержащих клеток селезенки.

Полученные результаты в опытных группах сравнивают с контролем

(группа мышей, не получавшая БАД). Увеличение количества АОК после вве-

дения БАД свидетельствует о поликлональной активности В-лимфоцитов.

д. Определение гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) к

эритроцитам барана.

Мышей одного веса, одной линии разделяют на 2 группы. Опытной

группе мышей вводят подкожно в межлопаточную область эритроциты барана

в дозе 10 млн. клеток на одну мышь в объеме 0,1 мл. Одновременно "per

os" этим же мышам вводят БАД. Вторая группа мышей - интактная. На 5

день всем мышам обеих групп в подушечку одной задней лапки вводят раз-

решающую дозу эритроцитов барана в концентрации 1 млрд. кл/мышь в объ-

еме 0,02 мл. В контрлатеральную подушечку лапки в том же объеме -

0,9%-ный раствор хлорида натрия. Местную воспалительную реакцию оцени-

вают через 18-20 ч путем определения веса опытной (Р) и контрольной

(Pk) лапок мышей. Забивают мышей хлороформом. Отделяют лапки по выступу

кости ниже сочленения большеберцовой кости и выше пяточного сустава.

Интенсивность местной реакции определяют по индексу реакции (ИР),

рассчитываемому по формуле:

ИР = (Po - Pk) : Pk x 100%

Препарат, влияющий на клеточное звено иммунитета, вызывает измене-

ние индекса реакции.

е. Определение фагоцитарной активности макрофагов под влиянием

БАД.

Опытной группе (3-5 мышей) вводят БАД в дозе, оптимальной для че-

ловека. Контролем служат интактные животные. От забитых животных полу-

чают перитонеальный эксудат (ПЭ) путем 2-3-кратного промывания брюшной

полости мышей средой 199, содержащей 5 ME гепарина в 1 мл. ПЭ собирают

в центрифужные пробирки, стоящие на льду. После центрифугирования ПЭ

при 150 g в течение 10 мин. клетки ресуспендируют в среде 199 с 10%-ной

сывороткой крупного рогатого скота, и антибиотиками (100 ев. в мл).

Концентрацию клеток доводят до 2 млн.кл/мл и разливают по 2 мл в чашки

Петри диаметром 40 мм. Чашки помещают в термостат с содержанием 5% уг-

лекислого газа. Через 1 ч смывают не прилипшие клетки раствором Хенкса,

добавляют 2 мл среды 199 и помещают в термостат с углекислым газом на

18-24 ч.

Объектом фагоцитоза могут служить эритроциты барана, лабораторные

штаммы Staphilococcus или любые другие микроорганизмы.

Суточные культуры живых или убитых прогреванием при температуре

(90(+-)2) град. Цельсия микроорганизмов отмывают не менее трех раз

0,9%-ным раствором хлорида натрия. Определяют концентрацию суспензии

микробных клеток по стандарту оптической плотности. Суспензию клеток

разводят средой 199 до концентрации 10-20 млрд.кл/мл.

Эритроциты барана отмывают 3-кратно 0,9%-ным раствором хлорида

натрия центрифугированием при 800 g 5 мин. и готовят 0,5%-ную взвесь

эритроцитов в среде 199. Наливают 1 мл среды 199 в чашки Петри с клет-

ками ПЭ, затем вносят 1 мл взвеси эритроцитов барана или микроорганиз-

мов. Через 30-60 мин. в чашки Петри наливают холодный раствор Хенкса и

тут же выливают, высушивают и фиксируют клетки метанолом. Затем клетки

окрашивают азур-эозином по Романовскому-Гимзе.

При учете результатов необходимо просмотреть под микроскопом не

менее 200 клеток, подсчитывают фагоцитирующие клетки и количество эрит-

роцитов или микробов в одном макрофаге.

Подсчитывают процент фагоцитирующих клеток и фагоцитарное число.

Результаты, полученные в опытной группе, сравнивают с контролем.

ж. Оценка влияния БАД на продукцию растворимых медиаторов иммуно-

генеза-цитокинов.

Для определения продукции цитокинов клетки селезенки (КС) мыши ин-

кубируют в течение: 12-14 ч в присутствии ЛПС для инициации синтеза

ФИО; 24 ч в присутствии конканавалина А (Кон А) или фитогемагглютинина

(ФГА) для инициации синтеза ИЛ-2. Количественное содержание цитокинов

оценивают в надосадочных жидкостях при помощи цитокин-зависимых или ци-

токин-чувствительных клеточных линий.

з. Определение ФНО-.

Содержание ФНО- в исследуемых образцах надосадочной жидкости (НЖ)

КС мыши определяют по прямому лизису клеток ФНО-зависимой клеточной ли-

нии L-929 (фибробласты мыши) в присутствии актиномицина D (148). Клетки

пересевают по 2030 тыс./лунка в плоскодонные 96-луночные планшеты в

среде 199 с добавлением 5% инактивированной при 56 град. Цельсия сыво-

ротки крови крупного рогатого скота и инкубируют 24 ч при 37 град.

Цельсия. Образцы НЖ вносят в микропласты в разведениях 1:2-1:16 и инку-

бируют при 37 град. Цельсия в течение 16-20 ч. Результаты реакции учи-

тывают после окрашивания клеток 0,2%-ным раствором кристалл-виолета в

2%-ном этаноле в течение 12 мин. Оптическую плотность слоя выживших ок-

рашенных клеток измеряют при длине волны 540 им на спектрофотометре с

вертикальным лучом (Multiscan, Великобритания). В качестве стандарта в

данном тесте используют рекомбинантный ФНО-. Количество ФНО- в НЖ оце-

нивают в пкг/мл, используя калибровочные кривые, полученные при исполь-

зовании стандарта.

и. Определение ИЛ-2.

При определении ИЛ-2 КС мыши культивируют в концентрации 5х10(6) в

присутствии 5 мкг/мл Кон А в среде RPMI-1640, содержащей 2% сыворотки

АВ в течение 20-24 ч. Содержание ИЛ-2 в НЖ определяют по способности

образцов поддерживать пролиферацию ИЛ-зависимой цитотоксической клеточ-

ной линии.

CTLL-2 (лимфоциты мыши), оцениваемую по включению Н-тимидина в ДНК

клеток. Уровень включения радиоактивной метки определяют, с помощью

сцинтилляционного бета-спектрометра. В качестве контроля используют

раствор рекомбинантного ИЛ-2 с известной активностью. Количество ИЛ-2 в

НЖ оценивают в МЕ/мл, используя калибровочные кривые, полученные при

использовании стандарта.

к. Оценка влияния БАД на пролиферацию Т-лимфоцитов при циклоспо-

рин-индуцированной иммунодепрессии.

Мышей самцов линии Balb/c иммунизируют внутривенно эритроцитами

барана в оптимальной дозе (5x10(8)), с целью индукции иммунодепрессии

через 24 ч вводят циклоспорин А внутрибрюшинно в дозе 100 мг/кг. Через

4 ч изучаемую БАД в различных дозах, еще через 4 ч животных забивают,

извлекают клетки селезенки, которые культивируют с Кон А (митогеном,

реализующим свой эффект преимущественно на Т-клетки) в течение 72 ч.

Степень пролиферации клеток селезенки мыши оценивают по включению в ДНК

лимфоцитов тимидина, меченного тритием, который вносят в культуру за

4-6 ч до окончания инкубации. Количество включенного клетками изотопа

после соответствующей обработки измеряют на сцинтилляционном бета-счет-

чике (149).

л. Оценка влияния БАД на гуморальный иммунный ответ.

Мышей самцов Balb/c иммунизируют внутривенно эритроцитами барана в

оптимальной дозе (5x10(8)), через 24 ч вводят циклоспорин А (мощный им-

мунодепрессант, оказывающий свое действие преимущественно путем ингиби-

ции процессов активации Т-лимфоцитов) внутрибрюшинно в дозе. ЮО мг/кг,

еще через 4 ч - изучаемую БАД в различных дозах (рекомендуемая доза

обязательна). На 4 сутки после иммунизации определяют число антителооб-

разующих клеток в селезенке мыши методом локального гемолиза в агароз-

ном геле по JemeH Nordin (156).

Методы исследования аллергических свойств биологически активных

добавок к пище

1. Оценка влияния БАД на общую анафилактическую реакцию.

Морских свинок 200-250 г сенсибилизируют подкожно каким-либо чуже-

родным белком. Наиболее удобно использовать нормальную лошадиную сыво-

ротку или бычий сывороточный альбумин в дозе 0,1 мл и 10 мг соответс-

твенно. Одновременно свинкам вводят "per оs" или внутримышечно исследу-

емую субстанцию - это опытная группа животных. Контролем служит группа

свинок, не получавшая БАД на 14-21 день после иммунизации свинкам двух

групп внутри-сердечно, или внутривенно вводят ту же или удвоенную дозу

антигена, использованного для сенсибилизации. Реакция у животных насту-

пает через 1-2 мин. Наблюдают за животными в течение 30 мин.

Оценка реакции производится по четырехплюсовой системе:

А (+) - кратковременное почесывание носа, взъерошивание шерсти,

падение температуры (не менее чем на 1 град.);

Б (++) - четко выраженные частые почесывания, единичные чихания,

падение температуры;

В (+++) - спастический кашель, боковое положение животного, отде-

ление кала и мочи;

Г (++++) - спазм дыхательных путей, конвульсивные движения, судо-

роги. Животные погибают;

Д - реакция отсутствует.

Полученные результаты в контрольной группе сравнивают с результа-

тами в опытной группе.

В качестве положительного контроля используют животных, сенсибили-

зированных нормальной гетерологической сывороткой и получивших разреша-

ющую дозу в те же сроки. Одновременно разрешающую дозу испытуемой БАД

"per os" вводят животным, которые предварительно получили соответствую-

щий объем 0,9%-ного хлорида натрия - отрицательный контроль.

Индекс синдрома в группе вычисляют по формуле Вейгла (И):

(А x 1) + (Б x 2) + (В x 3) + (Г x 4)

И = -------------------------------------, где:

А + Б + В + Г + Д

А, Б, В, Г, Д - число животных с данной выраженностью синдрома.

Изучаемые БАД не должны вызывать развития смертельного шока.

Изучение действия БАД на показатели окислительно-антиокислительной

системы

Общие положения

К основным внутриклеточным химическим повреждающим агентам следу-

ет, в первую очередь, отнести свободные радикалы, образование которых

приводит к нарушению функционирования клеточных структур, включая био-

логические мембраны. Наибольшее значение для патологии имеют свободные

радикалы кислорода, а также пероксид водорода. Все эти так называемые

активные формы кислорода образуются в большом количестве клетками-фаго-

цитами, а также могут образовываться в митохондриях и эндоплазматичес-

кой сети других клеток в условиях патологии. Реагируя с ненасыщенными

жирными кислотами, входящими в состав мембранных липидов, радикалы ини-

циируют цепную реакцию их перекисного окисления. Реакции перекисного

окисления липидов (ПОЛ) тормозятся антиоксидантными системами клетки,

благодаря наличию которых скорость реакции образования гидроксильных

радикалов и разветвления цепи окисления липидов находится в пределах

физиологической нормы. Постоянное образование прооксидантов уравновеше-

но той же скоростью их дезактивации антиоксидантами. Резкое усиление

окислительных процессов, при недостаточности системы антиоксидантной

защиты приводит к развитию "оксидантного стресса", который рассматрива-

ется как один из общих механизмов повреждения тканей организма. Реакции

окислительного стресса являются результатом нарушения взаимоотношений

между оксидантной и антиоксидантной составляющими свободно радикальных

процессов за счет гиперактивности или недостаточности одного из указан-

ных компонентов. В ходе реализации окислительного стресса, являющегося

реакцией организменного уровня, создаются условия для развития специфи-

ческих для нервной системы патологических процессов, что в свою очередь

усугубляет окислительный стресс в центральной нервной системе (151).

В связи с вышеизложенным, БАД к пище следует изучать как по изме-

нению активности ферментных систем генерирования свободных радикалов

кислорода и гидроперекисей, так и по изменению содержания антиоксидант-

ных белков и ферментов, обеспечивающих утилизацию активных форм кисло-

рода, Н2О2 и липопероксидов.

Методы оценки действия БАД к пище на показатели перекисного

окисления липидов

Мышам-самцам линии Balb вводят 0,25 ил 7%-ного масляного раствора

СС14 - одного из сильнейших стимуляторов ПОЛ, внутримышечно или алимен-

тарно, через 15-20 мин. животным "per os" вводят исследуемую БАД к пище

(5 животных в группе), 5-ти мышам контрольной группы вводят аналогичный

объем физиологического раствора. Через 2 сут. животных забивают, выде-

ляют печень и определяют продукты перекисного окисления липидов, такие

как диеновые коньюгаты (появляются на начальных этапах перекисного

окисления), гидроперекиси липидов (обнаруживаются на более поздних эта-

пах перекисного окисления) и малоновый диальдегид (один из наиболее

важных конечных продуктов перекисного окисления липидов).

а. Определение малонового диальдегида в гомогенате печени мыши.

Печень мыши растирают в гомогенезаторе Поттера в 3 мл 0,025 М

трис HCl (рН 7,4), содержащей 0,175 М хлорида калия. Гомогенат по 2,5

мл помещают в центрифужные пробирки и осаждают белок добавлением 1 мл

17%-ного раствора ТХУ (конечная концентрация 5%). Образующийся осадок

отделяют центрифугированием в течение 10 мин. при 4000 g. Надосадочную

жидкость переносят в пробирки, добавляют по 1 мл 0,8%-ного водного

раствора 2-тиобарбитуровой кислоты и помещают пробы на 10 мин. в кипя-

щую водяную баню. В качестве контроля используют пробы, содержащие

вместо надосадочной жидкости буфер (рН 7,4). После развития розовой ок-

раски пробы охлаждают до комнатной температуры и измеряют оптическую

плотность при 532 им. Количество малонового диальдегида рассчитывают,

используя молярный коэффициент экстикции 1,56-10(5) см-' x М-', а полу-

ченный результат выражают в молях на пробу (152).

б. Определение диеновой коньюгации полиненасыщенных высших жирных

кислот в гомогенате печени мыши.

Печень мыши растирают в гомогенизаторе Поттера с 9 мл экстрагирую-

щей смеси гептана с изопропиловым спиртом в объемном отношении 1:1. По-

лученную суспензию центрифугируют 10 мин. при 4000 g. Надосадочную

фракцию переносят в пробирки и добавляют одну десятую часть объема дис-

тиллированной воды. После 2-кратного встряхивания и расслаивания фаз

отсасывают гитпановую фазу. К равным объемам по 0,5 мл добавляют этило-

вый спирт в отношении 1:5-1:10. Оптическую плотность проб измеряют при

233 нм. В качестве контроля используют только экстрагирующую смесь.

Содержание диеновых коньюгатов рассчитывают, исходя из величины

молярного коэффициента экстинкции при 233 им для сопряженных диенов

ПНЖК, равного 2,2 x 10(5) см-' x М-' (152).

в. Определение гидроперекиси липидов в гомогенате печени мыши.

Печень мыши растирают в гомогенизаторе Поттера в 3 мл 0,025 М трис

HCL буфера (рН 7,4), содержащей 0,175 М хлорида калия. Гомогенат по 2,0

мл помещают в центрифужные пробирки и осаждают белок добавлением 0,2 мл

50%-ного раствора ТХУ (конечная концентрация 5%). Образующийся осадок

отделяют центрифугированием в течение 10 мин. при 4000 g. 2 мл надоса-

дочной жидкости доводят 96%-ным этанолом до 27 мл. К равным объемам до

27 мл добавляют 0,1 мл концентрированной соляной кислоты и 0,025 мл

5%-ного раствора соли Мора в 3%-ной соляной кислоте, пробы интенсивно

встряхивают. Точно через 30 с. приливают 1 мл 20%-ного раствора тиоциа-

ната аммония, после чего развивается малиновая окраска. В качестве

контроля используют пробы, содержащие 96%-ный этанол вместо НЖ. Измене-

ние оптической плотности проводят в течение 10 мин. после добавления

тиоцианата аммония при 480 нм. Об относительном уровне гидроперекисей в

биологическом материале судят по величине оптической плотности при 480

нм (152).

12.3. Экспериментальная схема модели на лабораторных животных

для оценки эффективности профилактического действия

парафармацевтиков

Описание экспериментальных групп:

контроль - животные находятся на общевиварном рационе или на обыч-

ном полусинтетическом рационе;

опыт-1 - крысы вместе с рационом получают изучаемую БАД к пище на

протяжении одного месяца;

опыт-2 - крысы на протяжении первого месяца находятся на общеви-

варном или обычном полусинтетическом рационе.

Через месяц от начала опыта у крыс групп опыт-1 и опыт-2 получают

модель патологического состояния или помещают их в экстремальные усло-

вия.

Далее, используя соответствующие тесты, оценивают профилактические

свойства изучаемой БАД.

Конкретные модели патологических и экстремальных состояний изложе-

ны в приложениях к разделу "Парафармацевтики".

13. О порядке проведения клинических испытаний

биологически активных добавок к пище

1. Клинические испытания биологически активных добавок к пище осу-

ществляются, как правило, в контролируемых условиях стационара или в

амбулаторных условиях в специализированных учреждениях, которые распо-

лагают квалифицированными специалистами в области науки о питании или в

соответствующей области медицины, современным научным оборудованием,

хорошей многопрофильной клинической базой и аккредитованных на проведе-

ние подобных исследований в порядке, установленном МЗ Кыргызской Рес-

публики

2. Образцы биологически активных добавок к пище предоставляются

фирмой в том количестве, которое предусматривается программой испыта-

ния.

3. Схема проведения испытаний биологически активных добавок к пище

включает следующие этапы:

- экспериментальную и/или аналитическую оценку основных компонен-

тов БАД к пище на основании представленной фирмой-производителем доку-

ментации и результатов исследований (см. разделы 4, 5, 6);

- разработку программ клинических испытаний биологически активных

добавок к пище, которая определяется, с одной стороны, особенностями

химического состава и предполагаемого биологического действия исследуе-

мых БАД на организм, применительно к тем нозологическим формам заболе-

вания, при которых использование добавок с профилактической целью

представляется наиболее адекватным и перспективным, а с другой стороны,

типом функциональных и метаболических нарушений, свойственных данной

патологии;

- определение методики проведения клинических испытаний. Для полу-

чения достоверных данных о профилактическом действии БАД к пище необхо-

димым условием является наличие двух групп:

основной (опытной) и контрольной. Они могут формироваться из здо-

ровых лиц или больных с определенной патологией. Группы сравнения долж-

ны быть максимально сходными по половозрастному признаку, массе тела,

пищевому статусу. В случае проведения испытаний на больных, помимо это-

го учитывается степень тяжести основного заболевания, характер сопутс-

твующей патологии. Оценка эффективности БАД к пище осуществляется на

фоне идентичных режимов питания в опытной и контрольной группах. Пред-

почтительным при этом является использование двойного слепого метода

испытаний с применением плацебо в контрольной группе. В процессе прове-

дения клинических испытаний определяются органолептические свойства БАД

и их переносимость, осуществляется оценка их эффективности, выявление

возможных побочных эффектов;

- помимо общих клинических показателей в план исследований включа-

ются гематологические и специальные функциональные тесты, биохимичес-

кие, микробиологические, иммунологические и другие показатели. Выбор

критериев оценки эффективности апробируемых БАД к пище определяется ха-

рактером испытуемых БАД и клинико-патогенетическими особенностями нозо-

логических форм, при которых они применяются;

- продолжительность клинической апробации устанавливается в зави-

симости от типа БАД к пище и по согласованию с фирмой-заявителем;

- в заключении по итогам испытания БАД должны быть представлены

результаты изучения переносимости БАД, ее эффективности, рекомендуемая

дозировка БАД, показания к применению, возможные побочные эффекты.

Клиническая оценка эффективности БАД к пище и их переносимости

1. Оценка органолептических свойств БАД и их переносимости.

Изучение органолептических свойств БАД осуществляется с использо-

ванием анкетно-опросного метода. Оценивается вкус, запах, цвет, консис-

тенция БАД, наличие посторонних запахов и т.д.

Переносимость БАД оценивается путем клинического наблюдения по

субъективным и объективным признакам. Исследуется:

- состояние кожных покровов;

- системы пищеварения;

- сердечно-сосудистой системы и других органов и систем организма.

2. Оценка БАД по общеклиническим показателям:

- определение росто-весовых параметров (с использованием индекса

Кегле);

- определение других антропометрических показателей (измерение ок-

ружности плеча, талии, бедер);

- определение тощей и жировой массы тела (по показаниям);

- оценка влияния БАД на общее состояние наблюдаемого контингента и

состояние различных органов и систем организма;

- общий анализ мочи и крови;

- определение биохимических показателей - содержание в сыворотке

крови общего белка, холестерина, билирубина, глюкозы, активности алани-

наминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы, креатинина, азота мочеви-

ны.

Все исследования осуществляются в динамике, как минимум 2 раза, до

применения БАД и после завершения курса лечения.

3. Перечень дополнительных специальных тестов, используемых, при

клинических испытаниях различных типов БАД.

3.1. Биологически активные добавки к пище - источники белка и

аминокислот

3.2. Биологически активные добавки к пище - источники липидов.

Биохимические показатели

3.3. Биологически активные добавки к пище - источники углеводов

3.4. Биологически активные добавки к пище, содержащие пищевые

волокна (ПВ)

При оценке БАД, содержащих пищевые волокна, используются:

- изучение характера стула;

- капрологическое исследование;

- инструментально-графические тесты, характеризующие моторно-эва-

куаторную функцию желудочно-кишечного тракта (по показаниям) (128);

- микробиологический анализ для характеристики изменений в 1 ки-

шечной микрофлоре под влиянием БАД (по показаниям) (125);

- дуоденальное зондирование с определением химического состава

желчи (по показаниям): концентрация холестерина, холевой кислоты, де-

зоксихолевой кислоты, фосфолипидов (124);

- микробиологический анализ желчи (по показаниям);

- изучение аноректического эффекта БАД;

- биохимические показатели:

3.5. Биологически активные добавки к пище - источники витаминов

При изучении эффективности БАД, основными компонентами которых яв-

ляются витамины, критерием оценки служит динамика изменения витаминной

обеспеченности организма под влиянием этих БАД к пище по содержанию ви-

таминов в сыворотке крови и выделению их с мочой.

3.6. Биологически активные добавки к пище - источники

минеральных веществ

Эффективность этой категории БАД к пище подтверждается путем изу-

чения динамики изменения концентрации соответствующих микро- или макро-

элементов в биологическом материале, а также тех биологических эффек-

тов, которые реализуются в организме в процессе накопления вводимых с

БАД нутриентов.

Так, эффективность содержащих железо БАД определяется по показате-

лям гемоглобинового и транспортного фонда железа:

3.7. Биологически активные добавки к пище с эубиотическим

действием на основе чистых культур микроорганизмов

Исследование влияния биологически активных добавок к пище на мик-

робиоценоз кишечника проводят с использованием питательных сред для

учета основных групп микроорганизмов:

Литературный источник: (112, 113).

4. Парафармацевтики, оказывающие влияние на состояние организма в

целом и состояние отдельных его систем

При исследовании воздействия парафармацевтиков, оказывающих влия-

ние на функциональное состояние организма в целом и отдельных его сис-

тем, используются методы врачебного контроля, характеризующие клиничес-

кое состояние пациентов, и соответствующие инструментально-лабораторные

показатели.

4.1. Парафармацевтики, оказывающие влияние на центральную и пери-

ферическую нервную систему.

а. Показатели, характеризующие психоэмоциональный статус пациента.

б. Влияние на сон.

в. Динамика артериального давления и пульса.

4.2. Парафармацевтики, влияющие на состояние сердечнососудистой

системы.

- Динамика артериального давления и частоты пульса.

- Электрокардиографическое исследование.

- Холтеровское мониторирование - по показаниям.

- Эхокардиография (по показаниям).

Лабораторные тесты:

4.3. Парафармацевтики, оказывающие влияние на пищеварительную сис-

тему.

Тесты, характеризующие состояние желудка:

- Изучение желудочной секреции (по показаниям).

а. "Тонкий зонд с нагрузкой" (пентагастрин, инсулин, гистаминпен-

тагастрин + глютамат натрия).

б. рН-метрия (2-3-точечная, 24-часовое исследование на переноси-

мость и реактивность пищи и ферментных препаратов).

в. Радиотелеметрия.

г. Рентгеноскопия желудка и 12-перстной кишки (по показаниям).

- Эзофагогастродуоденоскопия (по показаниям). Забор биопсийного

материала на морфологию, содержимое желудка на цитологию, исследование

на наличие хеликобактериоза.

- Исследование моторики пищевода и желудка (по показаниям).

Тесты, характеризующие состояние кишечника:

- Пассаж бария по тонкой кишке (транзит) (по показаниям).

- Ирригоскопия (по показаниям).

- Гептороманоскопия (по показаниям).

- Колоноскопия (по показаниям) (еюноперфузия).

- Исследование кишечного транзита радионуклидным методом (по пока-

заниям).

- Копрологическое исследование кала (по показаниям).

- Микробиологическое исследование кала на дисбактериоз.

- Исследование моторики кишечника инструментально-графическим ме-

тодом (по показаниям).

Тесты, характеризующие состояние поджелудочной железы:

- УЗИ поджелудочной железы (по показаниям).

- Эндоскопическая холангопанкреатикография (по показаниям).

- Исследование в сыворотке крови и, моче панкреатических фермен-

тов; в дуоденальном содержимом (по показаниям).

- Сцинтиграфия, сканирование поджелудочной железы (по показаниям).

4.4. Парафармацевтики, обладающие желчегонными, гепатопротекторны-

ми свойствами.

- Изучение желчевыделительной функции гепатобилиарной системы с

использованием дуоденального зондирования и определения химического

состава желчи (по показаниям) (124). Холецистографическое исследование

(по показаниям) для изучения динамики двигательной функции желчного пу-

зыря под влиянием БАД к пище.

- УЗИ желчного пузыря и печени.

- Микробиологический анализ желчи (по показаниям).

- Сцинтиграфия печени (по показаниям) (124).

- Сканирование печени (по показаниям) (124).

- Пункциональная биопсия печени (по показаниям).

Биохимические показатели

4.5. Парафармацевтики, обладающее диуретическими свойствами.

- Определение суточного диуреза.

- Контроль за уровнем артериального давления.

- Определение концентрации калия и натрия в сыворотке крови, эрит-

роцитах и моче (по показаниям).

- Определение кислотно-основного состояния крови (по показаниям).

- Показатели системы свертывания крови (по показаниям).

- Электрокардиографическое исследование в динамике.

4.6. Парафармацевтики, обладающие общеукрепляющим и противовоспа-

лительным действием.

По показаниям изучается состояние гуморального и клеточного имму-

нитета, интенсивность процессов перекисного окисления липидов и показа-

тели антиоксидантной защиты организма.

Показатели гуморального иммунитета - количество В-клеток (СД19,

СД20).

Иммуноглобулины основных классов (JgA, JgM, JgG) (132). Показатели

клеточного иммунитета - фенотипирование Т-клеток (СДз - общий Т - лим-

фоцитов СД4 - хелперы, СД8 - цитотоксические клетки супрессоры) (132).

Неспецифический иммунный ответ - компоненты системы комплемента,

определение числа фагоцитирующих клеток и фагоцитарного индекса, гене-

рация супероксидного аниона нейтрофилами (02*) (132).

4.7. Критерии анорексигенной активности БАД.

Оценка биологически активных добавок к пище анорексигенного дейс-

твия осуществляется по степени выраженности специфического эффекта и

динамике массы тела.

Критерии анорексигенной активности БАД.

Объективная оценка чувства голода проводится каждый день перед

приемом пищи в одно и то же время одним и тем же врачом по специальной

шкале: невыносимый голод - 5 баллов, голод с чувством "беспокойства - 4

балла, чувство голода - 3 балла, еда с аппетитом - 2 балла" еда без ап-

петита - 1 балл, отвращение к еде - 0 баллов.

О выраженности анорексигенного действия можно судить по частоте

приема БАД в течение дня.

Степень потери массы тела оценивается по коэффициенту потери массы

тела от исходной величины до лечения (ПИ). Коэффициент рассчитывается в

конце курса лечения по следующей формуле:

Е

ПИ = --- x 100%, где:

Т

Е - потеря массы тела;

Т - исходная масса тела.

При исследовании анорексигенного действия БАД необходима проверка

на отсутствие в их составе эфедрина и других психостимулирующих

средств. Метод определения эфедрина изложен в приложениях к данному

разделу.

5. Биологически активные добавки к пище могут быть разрешены к

применению без проведения клинических испытаний на основании экспертизы

необходимой документации:

а) при наличии представленных фирмой-изготовителем материалов,

свидетельствующих о клинических испытаниях эффективности предлагаемой

БАД; клинические испытания должны быть выполнены в уполномоченных на

проведение таких исследований учреждениях в Кыргызской Республике и/или

стране-изготовителе;

б) если БАД содержит отдельные нутриенты и их комплексы в дозиров-

ке уже установленной и апробированной для этого вида БАД в Кыргызской

Республике;

в) если парафармацевтики содержат изученные и уже использующиеся в

клинической практике растительные компоненты в дозах, установленных для

БАД в Кыргызской Республике.

Решение о необходимости проведения клинических испытаний принима-

ются, если:

а) фирмой-заявителем направляется на сертификацию БАД без соот-

ветствующей документации, подтверждающей ее эффективность результатами

проведенных клинических испытаний;

б) БАД содержит новые действующие ингредиенты;

в) требуется разрешение к применению в связи с новыми показаниями,

новой дозировкой, изменением состава, а также в случае изменения в тех-

нологическом регламенте.

Приложение 1

к разделу "Нутрицевтики"

Биологически активные добавки к пище -

источники белка и аминокислот

Показатели и методы оценки эффективности

Приложение 2

к разделу "Нутрицевтики"

Биологически активные добавки к пище - источники

липидов (эссенциальные и неэссенциальные

липидные компоненты пищи)

Определение содержания липидных компонентов в БАД к пище

Определение липидных компонентов в биологических жидкостях

(эффективность усвоения)

Приложение 3

к разделу "Нутрицевтики"

Биологически активные добавки к пище -

источники углеводов

Показатели и методы оценки эффективности и качества

Приложение 4

к разделу "Нутрицевтики"

Биологически активные добавки к пище -

источники витаминов

Определение содержания витаминов в БАД к пище

Определение содержания витаминов в биологических средах

Приложение 5

к разделу "Нутрицевтики"

Биологически активные добавки к пище -

источники минеральных веществ

Определение содержания минеральных веществ в БАД к пище

Определение минеральных веществ в биологических средах

Приложение 6

к разделу "Нутрицевтики"

Оценка эффективности биологически активных

добавок к пище, содержащих железо

Экспериментальные исследования на крысах

Описание групп крыс:

- контроль - контрольная группа крыс находится на обычном полусин-

тетическом рационе;

- опыт-1 и опыт-2 - у этих групп животных создается модель алимен-

тарной железодефицитной анемии. Для этого крысы этих групп рассаживают-

ся в специальные клетки (пластмассовые клетки без каких-либо железосо-

держащих составляющих с прорезями внизу, что исключает копрофагию у

крыс) и получают корм, из которого полностью исключено железо (при не-

обходимости отдельные компоненты полусинтетического рациона максимально

отмывают от железа). Состав экспериментального рациона: казеин - 22%,

подсолнечное масло (рафинированное - 10%, кукурузный крахмал - 60,7%,

целлюлоза - 3%, солевая смесь - 0,1% (без добавления железа), витамин-

ная смесь - 0,1%, холинхлорид - 0,1%. С подсолнечным маслом в корм вно-

сится ретинолпальмитат и витамин Д. Весь рацион готовится на деионизи-

рованной воде эту же воду в ходе эксперимента используют в качестве

питьевой воды. Скорость и глубину развития железодефицитной анемии

контролируют, определяя концентрацию гемоглобина в периферической кро-

ви. При снижении концентрации гемоглобина ниже 90 г/л считается, что у

животных имеется железо-дефицитная анемия. Для ее подтверждения часть

животных из группы опыт-1 забивают и определяют: концентрацию гемогло-

бина в периферической крови, концентрацию железа в сыворотке крови, об-

щую железосвязывающую способность сыворотки крови и рассчитывают коэф-

фициент насыщения трансферрина, содержание железа в сыворотке в печени

крыс, количество эритроцитов в периферической крови, мазок крови на на-

личие анизо- и пойкилоцитоза. При подтверждении железодефицитной анемии

животным группы опыт-2 в корм вносят исследуемую биологически активную

добавку к пище (с соответствующим расчетом на содержание железа). Восс-

тановление статуса железа в организме крыс в дальнейшем ходе экспери-

мента оценивают по концентрации гемоглобина, в крови. При восстановле-

нии концентрации гемоглобина в крови до величин, имеющих место у конт-

рольной группы животных, экспериментальных животных забивают и опреде-

ляют гематологические и биохимические показатели, характеризующие сос-

тояние обмена железа в организме. Важно определить содержание железа в

печени, т.к. этот показатель характеризует запасы железа в организме.

Приложение 7

к разделу "Нутрицевтики"

Биологические активные добавки к пище,

способствующие выведению из организма чужеродных

и токсичных веществ, продуктов обмена веществ

Приложение 1

к разделу "Парафармацевтики"

Оценка эффективности биологически активных добавок

к пище, применяемых в качестве ингибиторов

образования N-нитрозаминов

Известно, что наличие в пищевых продуктах азотсодержащих соедине-

ний (аминов, амидов, алкилмочевин и др.), а также нитратов и нитритов

может приводить к образованию канцерогенных N-нитрозаминов как в пище-

вом продукте, так и в организме, причем компоненты, входящие в состав

пищевого продукта, могут усиливать, замедлять или полностью ингибиро-

вать этот процесс. БАД к пище, являющиеся в основном высокоактивными

соединениями, могут играть важную роль как в экзогенном, так и в эндо-

генном образовании канцерогенных N-нитрозаминов. В связи с этим оценка

активности применяемых БАД к пище как ингибиторов образования канцеро-

генных N-нитрозаминов имеет важное значение.

Оценка эффективности ингибирования

нитрозирования в условиях IN VITRO

В среду, состоящую из 5 мл натурального желудочного сока pH

0,8-1,0, 0,5 мл водного раствора нитрита натрия (концентрация 30 мг/мл)

и 0,5 мл диэтиламина (концентрация 46,7 мг/мл), вносят 1 мл раствора

БАД к пище (БАД к пище растворяется в соответствующем растворителе,

концентрация БАД выбирается в зависимости от рекомендуемой дозировки),

энергично перемешивают до полного растворения, доводят рН раствора до

4,5 добавлением 0,1 н раствора соляной кислоты или 0,1 н раствора гид-

роокиси натри. Контрольный опыт проводят аналогично, но вместо раствора

БАД к смеси желудочного сока и предшественников нитрозаминов добавляет-

ся 1 мл соответствующего растворителя. Смеси (опыт и контроль) термос-

татируются при 37 град. Цельсия в течение 30 мин. Реакцию останавливают

добавлением 0,1 н раствора гидроокиси натрия (рН 8-9). Образовавшиеся

нитрозамины извлекают из смеси экстракцией свежеперегнанным метиленхло-

ридом.

Объединенные экстракты высушивают прокаленным сульфатом магния,

концентрируют и проводят идентификацию и количественное определение

нитрозаминов хемилюминисцентным методом (80) и (41).

Оценка эффективности ингибирования нитрозирования

в условиях IN VIVO

Крысы обеих групп (контроль и опыт) находятся на полусинтетическом

рационе. Каждому животному контрольной и опытной группы натощак вводят

желудочным зондом последовательно по 1 мл водных растворов нитрита нат-

рия (в пересчете на нитрит ион) и диэтиламина в дозах соответственно 15

и 24 мг/кг массы крысы. Животным опытной группы помимо предшественников

вводят 1 мл БАД к пище. Животным контрольной группы 1 мл соответствую-

щего растворителя, используемого для растворения БАД к пище. Ровно че-

рез 30 мин. после введения растворов всех животных забивают, отделяют

желудок вместе с содержимым, помещают в жидкий азот. Анализ N-нитроза-

минов осуществляют хемилюминисцентным методом (81) и (41).

Нитрозопролиновый тест

Крысы обеих групп находятся на полусинтетическом рационе.

Контроль - крысам натощак вводят 1 мл водных растворов нитрита

натрия и пролина в дозах соответственно 15 и 50 мг/кг массы тела живот-

ного. Опыт - крысам помимо нитрита натрия и пролина вводят натощак 1 мл

раствора БАД к пище. Крыс обеих групп помещают в обменные клетки на

сутки для сбора мочи, предварительно в сосуды для сбора мочи вносят 1

мл 30%-ного раствора гидроксида натрия. Собранную мочу замораживают до

минус 18 град. Цельсия и хранят до проведения анализа на содержание

нитрозопролина (не более 10 дней). Содержание нитрозопролина определяют

по (79).

Приложение 2

к разделу "Парафармацевтики"

Оценка влияния биологически активных добавок

к пище, предлагаемых в качестве защитных

средств от ионизирующего излучения

Экспериментальные исследования на крысах

Модель воздействия ионизирующего излучения.

Крысы контрольной и опытной групп получают однократное общее гам-

ма-облучение в дозе 8 Гр на установке "Хизотрон" с источником Со (Е -

1,25 МэВ) с расстояния 0,7 м. После облучения контрольная группа крыс

находится на обще-виварном рационе. Крысы опытной группы получают исс-

ледуемую БАД к пище вместе с кормом.

Ежедневно регистрируется гибель животных, взвешивание производится

каждые трое суток.

Характеристика проницаемости кишечного барьера

(экспериментальные исследования на крысах)

Модель воздействия ионизирующего излучения.

Крысы контрольной и опытной групп получают однократное общее гам-

ма-облучение в дозе 4 Гр на установке "Хизотрон" с источником Со (Е -

1,25 МэВ) с расстояния 0,7 м.

Данная доза не вызывает гибели животных в ранний период и характе-

ризуется обратимыми изменениями в морфофункциональном состоянии эпите-

лиального барьера тонкой кишки. Животные опытной группы на протяжении

10-14 дней перед облучением и в течение 2 суток после облучения получа-

ют с кормом исследуемую БАД к пище. Животные контрольной группы на про-

тяжении всего эксперимента получают общевиварный рацион.

Через сутки, после облучения животным опытной и контрольной групп

вводят внутрижелудочно, по 500 мг ПЭГ-4000 (Serva, Германия) и собирают

мочу в течение последующих 18 ч в обменных клетках. По окончании сбора

мочи крысам внутрижелудочно вводят по 500 мг куриного овальбумина (пя-

тикратно перекристаллизованного) и через 3 ч обескровливают под глубо-

кой эфирной анестезией. Препарат слизистой оболочки тощей кишки подвер-

гают морфометрическому исследованию на светооптическом уровне.

Из аликвоты мочи экстрагируют ПЭГ-4000 путем экстракции 10-кратным

объемом перегнанного хлороформа. Хлороформ отгоняют и сухой остаток

анализируют методом гель - проникающей хроматографии с рефрактометри-

ческим детектированием в системе метанол-вода 1:1 (88). Содержание

ПЭГ-4000 в пробах определяют по стандартному графику. Параллельно в

другой аликвоте мочи анализируют содержание креатинина с помощью коло-

риметрической реакции ЯФФЕ (89). Проницаемость кишечного барьера для

ПЭГ-4000 характеризуют величиной экскреции ПЭГ-4000 с мочой в процентах

от введенной дозы в расчете на 11 ммоль экскретируемого креатинина. В

сыворотке крови анализируют содержание антигенных структур куриного

овальбумина с помощью двухвалентного твердофазного иммуноферментного

метода (sandwich-ELISA), рекомендуемого как официальный метод ВОЗ (90).

Проницаемость кишечного барьера для нерасщепленного белка характе-

ризуется величиной его всасывания в кровь в процентах от внутрижелудоч-

но введенной дозы.

Приложение 3

к разделу "Парафармацевтики"

Оценка эффективности БАД к пище, рекомендуемых

для профилактики и вспомогательной терапии

при заболеваниях печени

Экспериментальное исследование на крысах с использованием модели

подострого токсического гепатита

Модели подострого гепатита:

- крысам вводится подкожно четыреххлористый углерод в дозе 2 мл/кг

массы крысы в смеси с подсолнечным маслом 1:1 через день на протяжении

одного месяца (91);

- пятикратное через 2 ч введение (внутримышечное) 50%-ного раство-

ра тетрахлорметана в оливковом масле по 0,3 мл на 0,1 кг массы тела

крысы (82).

Опыт-1 - 1-й месяц крысы находятся на общевиварном рационе первые

3 недели, далее - получение модели токсического гепатита (срок в зави-

симости от вида модели); 2-3-й месяц - на общевиварном рационе.

Опыт-2 - 1-й месяц крысы находятся на общевиварном рационе с вве-

дением в него изучаемой БАД к пище первые три недели, далее - получение

модели токсического гепатита (срок в зависимости от вида модели); 2-3-й

месяц - на общевиварном рационе с введением в него изучаемой БАД к пи-

ще.

Контроль - 1-й, 2-й и 3-й месяцы крысы находятся на общевиварном

рационе.

Забои животных проводятся: 1-й забой (забивают половину крыс из

каждой группы, 6-8 животных) сразу после получения модели гепатита, 2-й

- через 3-4 недели после первого забоя (вторая половина животных из

каждой группы).

Экспериментальные исследования, рекомендуемые для оценки данного

вида БАД: интегральные показатели, т.е. внешний вид животных, актив-

ность, масса тела, абсолютная и относительная масса внутренних органов.

Биохимические показатели

Морфологические методы: макро- и микроскопическое исследование пе-

чени.

Модели патологического состояния печени представлены также в сле-

дующих работах: острый тетрациклиновый гепатоз у крыс (83), хронический

гепатит (8), цирроз печени (117), другие модели токсического гепатита

(85-86).

Приложение 4

к разделу "Парафармацевтики"

Оценка эффективности БАД к пище, рекомендуемых

для профилактики и в качестве вспомогательных

средств при лечении сердечно-сосудистых заболеваний

Модели гиперлипиемий.

1. Крысы - введение детергентов (тритон WR-1339 225-220 мг/кг мас-

сы тела внутрибрюшинно однократно). Через 8-10 ч после введения тритона

WR-1339 наблюдается 6-8 кратное увеличение уровня триглицеридов в крови

и 3-4-кратное увеличение содержания холестерина (126).

2. Крысы - применение диеты, содержащей 3-5% холестирина, 0,3% ти-

оурацила, 1% холиевой кислоты. Дополнительно можно ввести витамин Д.

Гиперлипидемия возникает через 3-4 недели. Длительное применение этой

диеты с витамином Д (несколько месяцев) приводит к атеросклеротическому

поражению аорты (126).

3. Морские свинки - применение диеты, содержащей 1,6% холестирина

и 15% растительного масла. Через 6-10 дней развивается гиперлипидемия,

усиливающаяся при более длительном применении диеты (126).

4. Кролики - применение диеты, содержащей 0,2-0,3 г/кг холестерина

или введение холестерина зондом в подсолнечном масле в желудок в том же

количестве (126).

При изучении БАД к пище, рекомендуемой в качестве вспомогательного

или профилактического средства при лечении сердечно-сосудистых заболе-

ваний, в эксперименте на животных можно рекомендовать следующие показа-

тели для характеристики эффективности:

- интегральные показатели состояния животных - внешний вид, актив-

ность, масса тела, относительная масса внутренних органов;

- специальные показатели - артериальное давление, электрокардиог-

рафическое исследование.

Биохимические показатели

Макро- и микроскопические морфологические исследования сердца и, в

случае необходимости, сосудов.

Приложение 1

к разделу 13

Определение содержания эфедрина

2-3 г препарата, взвешенного с точностью до 0,01 г, обрабатывают

однонормальным HCI 3 раза по 10 мл. Из объединенного экстракта удаляют

липидные компоненты хлороформом 3 раза по 10 мл. Водный слой подщелачи-

вают десятинормальным NaOH до pH 10 и хлороформом выделяют эфедрин.

Хлороформовый экстракт упаривают на роторном испарителе, экстракт раст-

воряют в 1 мл хлороформа и 1 мкл вводят в хроматограф.

Анализ проводят на хроматографе с пламенно-ионизационным детекто-

ром на полярной колонке при температуре 120 град. Цельсия. В этих же

условиях анализируют стандартный раствор эфедрина (0,1 мг в 1 мл хлоро-

форма). Содержание эфедрина выражают в мг на 100 г препарата и рассчи-

тывают по формуле:

Сст - Нпр

Спр = --------- x 1000, где:

Нст x qпр

Cпр - содержание эфедрина в препарате в мг на 100 г;

Сст - концентрация эфедрина в стандартном растворе;

Hпр - интегральный показатель пика эфедрина в препарате;

Hст - интегральный показатель пика эфедрина в стандартном раство-

ре;

qпр - навеска препарата в г.

Список литературы

1. Методические указания по атомно-абсорбционным методам определе-

ния токсичных элементов в пищевых продуктах и пищевом сырье. № 02,

19/47-11.

2. ГОСТ 26927-86 "Сырье и продукты пищевые. Метод определения рту-

ти".

3. ГОСТ 26930-86 "Сырье и продукты пищевые. Метод определения

мышьяка".

4. Методические указания по определению микроколичеств пестицидов

в продуктах питания, кормах, внешней среде: Сб. 1976, 1991. Ч. 5-18.

5. Методические указания, по выделению, идентификации и количест-

венному определению насыщенных и моно-, би-, триряда полициклических

ароматических углеводородов в пищевых продуктах. № 4721-88.

6. Афлатоксины В и М. Методические указания по обнаружению, иден-

тификации и определению содержания в продовольственном сырье и пищевых

продуктах с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. №

4082-86.

7. ГОСТ 28001-88 "Зерно фуражное, продукты его переработки, комби-

корма. Методы определения микотоксинов: Т-2 токсина, зеараленона охра-

токсина А".

8. Методические указания по обнаружению, идентификации и определе-

нию содержания дезоксиниваленола и зеараленона. N 5177-90.

9. Методические указания по обнаружению, идентификации и определе-

нию содержания Т-2 токсина в пищевых продуктах и продовольственном

сырье. № 3184-84.

10. Методические указания по определению остаточных количеств ан-

тибиотиков в продуктах животноводства N 3049/84.

11. ГОСТ 10444.15-94 "Продукты пищевые. Методы определения коли-

чества мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганиз-

мов".

12. ГОСТ 50474-93 "Продукты пищевые. Методы выявления и определе-

ния количества бактерий группы кишечных палочек (колиформных бакте-

рий)".

13. СанПиН 42-123-4049-88 "Микробиологические нормативы и методы

анализа продуктов детского, лечебного и диетического питания и их ком-

понентов". С.54-57.

14. ГОСТ 104442-93 "Продукты пищевые. Метод выявления и определе-

ния Staphylococcus aureus".

15. ГОСТ 10444.8-88 "Продукты пищевые. Метод определения Bacillus

cereus".

16. ГОСТ 50480-93 "Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода

Salmonella".

17. ГОСТ 10444.12-88 "Продукты пищевые. Метод определения дрожжей

и плесневых грибов".

18. СанПиН 42-123-4940-88. "Микробиологические нормативы и методы

анализа продуктов детского, лечебного и диетического питания и их ком-

понентов" - С.71-72.

19. СанПиН 42-123-4940-88. "Микробиологические нормативы и методы

анализа продуктов детского, лечебного и диетического питания и их ком-

понентов". С.71-73.

20. СанПиН 42-123-4940-88 "Микробиологические нормативы и методы

анализа продуктов детского, лечебного и диетического питания и их ком-

понентов". С.69-70.

21. ГОСТ 50474-93. "Методы выявления и определения количества бак-

терий группы кишечных палочек (колиформных бактерий)" или Сан-

ПиН-42-123-4940-88 "Микробиологические нормативы и методы анализа про-

дуктов детского, лечебного и диетического питания и их компонентов"-

С.51-54.

22. СанПиН 42-123-4940-88 "Микробиологические нормативы и методы

анализа продуктов детского, лечебного и диетического питания и их ком-

понентов" - С.61-63.

23. Биохимические методы исследования в клинике /Под ред. Покровс-

кого A.A. M.: Медицина, 1969. 85 с.

24. Pellеt H.L., Young V.R. Nutritional Evaluation of Protein Fo-

ods. The United Nations University Tokyo, Japan, 1980.

25. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник /Под

редакцией Меньшикова В.В. М.: Медицина, 1987. С.174-175.

26. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник /Под

редакцией Меньшикова В.В. М.: Медицина, 1987. С.176.

27. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник /Под

редакцией Меньшикова В.В. М.: Медицина, 1987. С.177-179.

28. Iupac. Standart metods for the analysis of oil, fats and deri-

vatives. 2.302 Pergamot press, 1979.

29. Fox J.М. in phosphatidilcholine. Peeters /ed/ Springer Berlin,

1976.-P.3-7.

30. Левачев М.М., Медведев Ф.А., Гарбузов А.Г. и др. //Прикладная

биохимия и микробиология. 1988. № 3. С.24.

31. Левачев М.М., Корф И.И. - Журнал "Вестник" № 10 - С.17.

32. Кейтс М. Техника липидологии. М.: Мир, 1975. С. 163, 259.

33. Якушина Л.М., Бендер Е.Д., Харитончик Л.А. //Вопросы питания.

1993. № 1. С.43-47.

34. Теоретические и клинические аспекты науки о питании /Под ред.

Волгарева М.Н. 1987. Т.8. 210 с.

35. Теоретические и клинические аспекты науки о питании /Под ред.

Волгарева М.Н. 1987. Т.8. 210 с.

36. Якушина Л.М., Таранова А.Г. //Ж.физ.хим. 1994. № 10.

С.1826-1828.

37. Сокольников А.А., Коденцова В.М., Исаева В.А. //Вопросы мед.

хим. 1993. № 3. С.50-53.

38. Коденцова В.М.; Вржесинская О.А., Рисник В.В. //Прикладная би-

охимия и микробиология - 1994, № 4-5. С.603-609.

39. Коденцова В.М., Рисник В.В. и др. //Клин. лаб. Диагностика -

1993. № 6. С.22-27.

40. Коденцова В.М., Вржесинская О.А., Сокольников А.А. //Вопросы

питания - 1992. № 2. С.62-67.

41. МУК 4.4.1.0.11-93 "Определение летучих N-нитрозаминов в продо-

вольственном сырье и пищевых продуктах".

42. МУК 4.1.033-95 "Методы контроля. Химические факторы, определе-

ние селена в продуктах питания".

43. Dona V., Papagni V., Tarenghy V. et.al //J.Ital. Chim. 1987. №

12. P.205-214.

44. Keller S.Schieter S. Vc.Kednee F. //J. Immunology Meth. 1981.

№ 51. P.287-291.

45. Stiglic N. Vlohovic V. e.tal. //Acta Рас.Меt.flumin. 1978. №

15. P.15-17.

46. Omura Т., Sato R. //Biol Chem. 1964. № 239. P.2370-2377.

47. Карузина И.И., Арчаков А.И. Современные методы в биохимии. М.:

Медицина, 1977. С.49-62.

48. Fuov F., Azyrv U. Kamattaki. T.et.al. //J.Pharmac. 1979. № 29.

P.191-201.

49. Dehnen W. et.al. //Anal-Bioch. 1977. № 53. P.373-383.

50. Lake В.Y. //Biochem. Toxicol. 1987. P.207-209.

51. Lake B.Y. //Biochem. Toxicol. 1987. P.209-211.

52. Лингл Д. Лизосомы. Методы исследования. 1980.

53. Кравченко Л.В., Соболев В.С. //Бюлл. эксперим. биологии и ме-

дицины - 1989 - № 8. С.179-181.

54. Book К.W. et.al. //Biochem. Рharmac. 1980. № 29. P.495-500.

55. Mendoza C.E. et.al. //Comh. Bioc. Phesiol. 1971. № 40.

P.841-854.

56. Cheetman N.W. et.al. //J. of Chromatography. 1981. № 207.

Р.439-444.

57. Любченко П.Н. Клиническая лабораторная диагностика. 1994.

С.6-7.

58. Меньшиков В.В., Ванштейн В.В. //Лаб. Дело. 1984. № 5. С.84.

59. Современные методы в биохимии. М.: Медицина, 1977. С.127-131.

60. Young D.S. et. al. //J.Clinical Chemistry - 1975. V.5. P.432.

61. Госфармакопея ГФ XI. Т.1. 1989.

62. Госфармакопея ГФ XI. Т.2. 1990.

63. Георгиевский В.П., Комисаренко Н.Ф., Дмитрук С.Е. Биологически

активные вещества лекарственных растений. Новосибирск: Наука, 1990.

64. Drawert F., Leopold Е. //J.Chromatogr. 1976. V.2. № 12.

P.505-510.

65. Marine D., Belestrieri F.Ital //J.Food. 1995. 7. № 3. P.255.

66. T S.Chamble, B.Clark //J.Arg. Food Chem. 1991. 39. P.162-169.

67. Ляпков Б.Г., Воробьева Л.Ш., Медведев Ф.А. Экстракционное кон-

центрирование и ХМС-определение d-лимонена в маслах цитрусовых и других

биологических образцах //ЖАХ. Т.84. № 4. 1996. С.451-454.

68. Международная фармакопея. Изд. 3. 1990. Т.3.

69. Сборник международных методов анализа и оценки вин и сусел.

Пищевая промышленность, 1993.

70. Svenson J.Q.J. Chromatogr., 230 Biochem Appl 19, 427, (1982).

71. Christophersen A.S. et.al. J.Chromatogr. 168, 476, (1979).

72. Official metods of analysis of AOAC 15th ed 1990 v. 1, 2.

73. ГОСТ 9517-94 "Топливо твердое. Методы определения выхода гуми-

новых кислот".

74. "Таблетки мумие экстракта, покрытые оболочкой". Временная фар-

макопейная статья ВФС 68-86-93, МЗ Республики Кыргызстан.

75. Курчубеков Б.П., Нарбеков О.Н. Кыргызский горный бальзам-мумие

"Архар-Таш". Бишкек, 1992.

76. ГОСТ 28038-89 "Продукты переработки плодов и овощей. Метод оп-

ределения микотоксина патулина".

77. Методические рекомендации по определению нитратов и нитритов в

молоке и молочных продуктах, 1990.

78. Методические указания но определению нитратов и нитритов в

зерне и зернопродуктах, 1990.

79. Вопросы питания. 1997. № 4. C.16-18.

80. Вопросы питания. 1996. № 3. С.31.

81. Вопросы питания. 1994. № 4. С.32.

82. Экспериментальная и клиническая фармакология. 1992. № 6.

С.49-50.

83. Макаренко Т.Н., Дудченко А.М., Лукьянова Л.Д. Разработка моде-

ли острого тетрациклинового гепатоза у крыс и получение его динамичес-

ких предикторов //Бюлл. экспериментальной биологии и медицины. 1994. №

12. С.603-606.

84. In vivo correlation between liver and blood energy status as

evidenced by chronic treatment of carbon tetrachloride and adenosine to

rats Hernandez-Munoz Rolando, Sanchez Victoria Chagoya //Can. J. Physi-

ol. and Phannacol. 1994. 72. № 10. С.1252-1255.

85. Зимин Ю.В., Солопаева И.М. Влияние хорионического гонадотропи-

на на активность лактатдегидрогеназы и алкогольдегидрогеназы патологи-

чески измененной печени //Бюлл. экспериментальной биологии и медицины.

1994. N 6. С.59-593.

86. Дроговоз С.М., Сальникова С.И. Эффективность оксикоричных кис-

лот при токсических поражениях печени //Бюлл. экспериментальной биоло-

гии и медицины. 1993. № 2. С.55-57.

87. Конопля Е.Н., Прокопенко Л.Г. Эссециале как иммуномодулятор

при токсическом поражении печени //Экспериментальная и клиническая фар-

макология. 1992. № 6. С.49-50.

88. Гмошинский И.В., Радченко С.Н., Зорин С.Н., Мазо В.К. Коррек-

ция диетой проницаемости защитного барьера кишки при гамма-облучении

(Физиол. журн. им.И.М.Сеченова. 1996. Т. 82. № 3. С.117-124.

89. Биохимические методы исследования в клинике /Под ред. Покровс-

кого А.А. М.: Медицина, 1969. С. 62-63, 103.

90. Stuart С.A., Twistelton R., Nicholas М.К., Hide D.W. Passage

of cows milk proteins in breast milk //Clin.Allergy. 1984. V.14. № 6.

P.533-535.

91. Шамсудинов Ш.Н. Физиологическая эффективность травы полыни

эстрагона при некоторых экстремальных условиях: Автореферат на соиска-

ние ученой степени кандидата биологических наук.

92. Биохимические методы исследования в клинике /Под ред. Покровс-

кого А.А. М.: Медицина, 1969. С.118.

93. Биохимические методы исследования в клинике /Под ред. Покровс-

кого А.А. М.: Медицина, 1969. С.156.

94. Биохимические методы исследования в клинике /Под ред. Покровс-

кого А.А. М.: Медицина, 1969. С.144.

95. Биохимические методы исследования в клинике /Под ред. Покровс-

кого А.А. М.: Медицина, 1969. С.124.

96. Биохимические методы исследования в клинике /Под ред. Покровс-

кого А.А. М.: Медицина, 1969. С.179.

97. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник /Под

ред. В.В.Меньшикова. М.: Медицина, 1987. С.227.

98. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник /Под

ред. В.В.Меньшикова. М.: Медицина, 1987. С.207.

99. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник /Под

ред. В.В.Меньшикова. М.: Медицина, 1987. С.177.

100. Биохимические методы исследования в клинике /Под ред. Пок-

ровского А.А. М.: Медицина, 1969. С.103.

101. Биохимические методы исследования в клинике /Под ред. Пок-

ровского А.А. М.: Медицина, 1969. С.98-101.

102. Биохимические методы исследования в клинике /Под ред. Пок-

ровского А.А. М.: Медицина, 1969. С.102.

103. Биохимические методы исследования в клинике /Под ред. Пок-

ровского А.А. М.: Медицина, 1969. С.300.

104. Биохимические методы исследования в клинике /Под ред. Пок-

ровского А.А. М.: Медицина, 1969. С.294.

105. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник /Под

ред. В.В.Меньшикова. М.: Медицина, 1987. С.238.

106. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник /Под

редакцией В.В.Меньшикова. М.: Медицина, 1987. С.107-122.

107. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник /Под

редакцией. В.В.Меньшикова. М.: Медицина 1987. С.248.

108. Фенотипирование гиперлипидемий: Методические рекомендации.

Под ред. Климова А.Н. - 1975.

109. Zanetti G. Rabbit liver glutation reductase. Purrification

and properties //Arch. biochem and biophys. 1979. V.198. № 1.

Р.241-246.

110. Иргашев Ш.Б., Юлдашев Н.М., Гурнев С.Б., Хадиметова Ш.А.,

Эльмуратов М.Т. Процессы гидроксилирования и интенсивность ПОЛ в микро-

сомах печени при экспериментальном инфаркте миокарда //Патологическая

физиология и экспериментальная терапия. 1993. N 3. С.19-20.

111. Wendel A.Glutathion peroxidase //Method in Ensymol - 1989 -

V.77. P.325-333.

112. Применение бактерийных биологических препаратов в практике

лечения больных кишечными инфекциями, диагностика и лечение дисбактери-

оза кишечника: Методические рекомендации. М., 1986.

113. Диагностика и диетотерапия пищевой аллергии: Методические ре-

комендации. М., 1984.

114. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник /Под

редакцией В.В.Меньшикова. М.: Медицина, 1987. С.155-172.

115. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник /Под

редакцией В.В.Меньшикова. М.: Медицина, 1987. С.191.

116. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник /Под

ред. В.В.Меньшикова. М.: Медицина, 1987. С.179.

117. Патологическая физиология и экспериментальная терапия № 4.

С.38-39.

118. Оценка физической работоспособности //Экспериментальная и

клиническая фармокология. 1992 - N 2. С.39-41.

119. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник /Под

ред. В.В.Меньшикова. М.: Медицина, 1987. С.47-59.

120. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник /Под

ред. В.В.Меньшикова. М.: Медицина, 1987. С.66-79.

121. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник /Под

ред. В.В.Меньшикова. М.: Медицина, 1987. С.267-270.

122. Покровский А.А., Арчаков А.И. Методы разделения и ферментной

идентификации субклеточных фракций. В кн.: Современные методы в биохи-

мии. М.: Медицина, 1968 - С.5-59.

123. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник /Под

ред. В.В.Меньшикова. М.: Медицина, 1987. С.192-194.

124. Морфологическая диагностика заболеваний печени /Под ред.

В.В.Серова. М.: Медицина, 1989. С.336.

125. Кресноголовец В.Н. Дисбактериоз кишечника. М.: Медицина,

1989. С.208.

126. Экспериментальное изучение гиполипидемических и антиатероск-

леротических средств: Методические рекомендации, Фармакологический Ко-

митет. М., 1988.

127. СанПиН 2.3.2.560-96 "Гигиенические требования к качеству и

безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов.

128. Кишковский Н.А. Дифференциальная диагностика в гастроэнтеро-

логии. М.: Медицина, 1984. С.288.

129. Коллинз У.П. Новые методы иммуноанализа. М.: Мир, 1991.

С.140-149.

130. Пол У. Иммунология. М.: Мир, 1987. Т.1. С.93-96.

131. Фримель Г. Иммунологические методы исследования. М.: Медици-

на, 1987. С.4.

132. Методы исследования в иммунологии /Под ред. Лефковиц И. и

Пернис Б. Т. 1, 2.

133. Тиц Н. Энциклопедия клинических лабораторных тестов. М.: Ла-

бинформ, 1997.

134. Тутельян В.А. Биологически активные добавки к пище: прошлое,

настоящее, будущее //Тезисы второго Международного симпозиума. Питание

и здоровье. Биологически активные добавки к пище - С.164-166.

135. Пыцкий В.И. - В кн.: Патологическая физиология /Под ред.

А.Д.Адо и В.В.Новицкого - С.73-75.

136. Крыжановскин Г.Н., Магаева С.В., Макаров С.В. Нейроиммунопа-

тология. М., 1997. С.7.

137. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробио-

логических исследованиях. Л., 1962.

138. Крендаль Ф.П., Левина Л.В., Чубарев В.Н. и др. Фармакологи-

ческое исследование адаптогенного (резистогенного) действия настойки из

биомассы культуры ткани корня женьшеня. - В кн.: Новые данные об элеу-

терококке и других адаптогенах - С.123-130.

139. Меерсон Ф.З. Механизмы и защитные эффекты адаптации. В кн.:

Адаптационная медицина. М., 1993. С.25-31.

140. Горизонтов П.Д. Гомеостаз, его механизмы и значение. Гомеотаз

/Под ред. Горизонтова П.Д. М.: Медицина, 1981. С.5-28.

141. Меерсон Ф.З. Основные закономерности индивидуальной адапта-

ции. В кн.: Физиология адаптационных процессов: Руководство по физиоло-

гии. Наука, 1986. С.10-76.

142. Меерсон Ф.З. Общий механизм адаптации и роль в нем стресс-ре-

акции, основные стадии процесса. В кн.: Физиология адаптационных про-

цессов: Руководство по физиологии. Наука, 1986. С.77-123.

143. Петров А.В., Быков Э.Г. Методологические аспекты проблемы

адаптации. Формы и механизмы процессов адаптации. В сб. научных трудов:

Формы и механизмы процессов адаптации в норме и патологии - С.5-29.

144. Beutler В., Ceram A. The biology of cachectin. TNF-a primariy

mediator of the host response //Annu. Rev. Jmmunol. 1989. Vol.7.

P.625-655.

145. Beutle В., Cerami A. Tumor necrosis, cachexia, shock, and

inflammation: a common mediator //Annu. Rev. Biochem. 1988. Vol.57.

P.505-518.

146. Beuler В., Greenwald D., Hulmes J.D. et. al. Identity of tu-

mor necrosis factor and the macrophage-secreted factor cachectin //Na-

ture. 1985. Vol. 316. P.552-554.

147. Гублер Е.В., Генкин А.А. Применение непараметрических крите-

риев статистики в медико-биологических исследованиях. Л., 1973. С.97.

148. Fisch H., Gifford J.E. A photometric and plaque assay for

macrophage mediated tumor cell cytotoxity //J.Immunol. Meth. 1983.

Vol.57. Р.311-325.

149. Ковальчук Л.В., Константинов А.А., Павлюк А.С. Клиническое

значение фактора роста Т-клеток (интерлейкинов для оценки иммунного

статуса человека //Иммунология. 1986. Т.4. С.52-55.

150. Jerne N.К., Nordin A.A. Plaque formation in agar by single

antibody production //Science. 1963. Vol.140. P.405.

151. Завалишин И.А., Захарова М.Н. Оксидантный стресс. - общий ме-

ханизм повреждения при заболеваниях нервной системы. 1996. Т.2.

С.11-114.

152. Орехович В.Н. Современные методы в биохимии. Медицина, 1977.

С.62-69.

153. Кондратенко И.В., Ярилин А.А., Хахалин Л.Н. Исследование про-

дукции интерлейкина-2 лимфоцитами больных с иммунодефицитами (сравни-

тельная характеристика различных методов тестирования) //Иммунология -

1991. Т.6. С.77-80.

154. Петров Р.В., Павлюк А.С., Ковальчук Л.В. и др. Интерлейкинза-

висимые иммунодефициты человека //Иммунология, 1987. Т.4. С.20-24.

155. Ebert Е.С., Stoll D.В., Cassens В.J. et al Diminished inter-

leukin 2 production and receptor generation characterize the acquried

immunodeficiency syndrome. Clin. Immunol. Immunopatol. 1985. Vol.37.

P.283-297.

156. Цезий-137. Определение в пищевых продуктах: Методические ука-

зания 5779-91. Свидетельство МА МВИ ИБФ № 15/1-89.

157. Стронций-90. Определение в пищевых продуктах: Методические

указания 5778-91. Свидетельство МА МВИ ИБФ № 14/1-89.